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目的：肿瘤的多药耐药是癌症化疗失败的主要原因之一，多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时,对其他结构和功能各异的药物亦产生交叉耐药现象。P-糖蛋白（P-glocoprotein，P-gp）是一种由MDR1基因编码的多药耐药相关蛋白，它是ATP依赖的药物外排泵，能够将已经进入细胞内的化疗药物排出细胞外，从而导致化疗失败。肿瘤细胞经化疗后能快速表达MDR1基因的mRNA，而小干扰RNA（Small Interference RNA，siRNA）能引起同源目标mRNA降解，从而导致特定基因表达沉默，因此，利用siRNA抑制MDR1基因mRNA的表达将是逆转肿瘤多药耐药的可行手段。本研究拟筛选能有效抑制MDR1基因表达的siRNA，构建带有U6和H1双启动子的siRNA表达质粒，制备siRNA表达载体的阳离子脂质体，并与化疗药物联用逆转乳腺癌细胞的多药耐药性，为siRNA药物的研发和肿瘤多药耐药的基因治疗奠定基础。方法：（1）siRNA序列的设计：以人的MDR1基因（序列号NM000927）为靶标，根据siRNA设计软件得到大量siRNA备选序列，利用生物学信息学对mRNA二级结构分析，并运用BLAST进行同源性分析，确定最终序列，由生物公司直接合成。（2）筛选有效的siRNA序列：将siRNA转染入乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中，分别在mRNA水平（Realtime PCR）和蛋白水平（Western Blot）对MDR1基因的表达进行定量分析，筛选高抑制效率的siRNA序列用于后续实验。（3）对筛选出来的有效siRNA做进一步的检测：MTT法检测转染细胞对阿霉素的敏感性，Realtime PCR法做量效关系曲线，以确定其有效浓度范围。（4）构建siRNA表达载体：化学方法合成两条与siRNA序列相对应的互补的单链DNA，两端带有Hind III和Bgl II酶切位点，退火后与经过Hind III和Bgl II双酶切的质粒pDual进行连接。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5а，次日挑取单克隆菌落扩增培养，提取质粒并进行测序鉴定。（5）制备siRNA表达载体的阳离子脂质体并对其进行理化性质分析：将阳离子脂、PEG化脂和胆固醇以一定比例混合，通过乙醇注入法制备空白脂质体，将空白脂质体和siRNA表达质粒溶液等体积快速混合，向脂质体内主动装载核酸，得到siRNA质粒的纳米阳离子脂质体。测定脂质体的电位、粒径和包封率等物理参数，并对siRNA脂质体的化学稳定性进行检测，包括酶切稳定性及血清稳定性。（6）siRNA质粒脂质体在小鼠体内的药代动力学研究：利用Realtime PCR法建立siRNA质粒脂质体检测的方法学，确定检测的标准曲线，在此基础上，对小鼠体内质粒进行检测并求得半衰期。（7）siRNA质粒脂质体的体外药效学研究：RealtimePCR法检测乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR转染siRNA质粒脂质体后MDR1基因的mRNA表达水平，SRB法检测细胞转染siRNA质粒脂质体后对阿霉素的敏感性。（8）siRNA质粒脂质体的体内药效学研究：建立NOD SCID小鼠乳腺癌多药耐药模型，按肿瘤体积将动物均衡分成三组，分别为空白对照组、阿霉素组、siRNA脂质体与阿霉素联用组。尾静脉注射给药，间隔一周给药一次，每天观察小鼠状态，隔天测肿瘤体积及动物体重。动物实验结束后，全部小鼠处死并剥瘤，观察肿瘤大小，称瘤重并计算抑瘤率，同时用Realtime PCR检测肿瘤组织中MDR1基因的mRNA表达水平。结果：（1）siRNA序列的设计：根据siRNA设计原则设计MDR1基因的siRNA，并进行mRNA二级结构以及同源性分析后，得到8条siRNA序列。（2）筛选有效的siRNA序列：Realtime PCR结果显示，与对照组相比，阴性对照组无显著差异；转染siRNA4、siRNA5、siRNA6、siRNA8组无统计学意义，没有沉默MDR1基因的作用；阳性对照组及转染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA7组MDR1表达水平分别下调63%（P<0.05）、83%（P<0.0001）、68%（P<0.0001）、68%（P<0.01）、70%（P<0.0001），说明这些siRNA序列能有效沉默MDR1基因。WesternBlot结果显示，与对照组相比，转染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA7组p-糖蛋白表达水平分别下调23%（P<0.001）、45%（P<0.001）、36%（P<0.001）、37%（P<0.001）、29%（P<0.001），说明这些siRNA序列能有效抑制MDR1基因表达，其中siRNA1的作用最明显，备选用于下一步实验。（3）对筛选出来的siRNA1做进一步的检测：MTT结果显示，MCF-7/ADR+siRNA1组对阿霉素的敏感性明显高于MCF-7/ADR组，差异具有显著性（P＜0.05）。由低浓度到高浓度，细胞对阿霉素的敏感性依次上调17%、45%、49%、42%、25%、1%。Realtime PCR量效关系曲线显示，随着siRNA1浓度的加大，沉默效率逐渐升高，最高抑制率为81.7%。（4）成功构建了siRNA表达载体，测序图谱显示表达载体中插入的DNA片段的基因序列与理论序列一致。（5）siRNA质粒脂质体的制备及理化性质分析结果：成功制备siRNA表达质粒的阳离子脂质体，且脂质体的粒径及电位均符合要求，包封率高达88.32%。电泳结果表明质粒经脂质体包裹后在DNaseⅠ及血清中的稳定性远远高于裸质粒，说明质粒经包裹后得到了有效的保护。（6）siRNA质粒脂质体的药代动力学研究：根据实验数据作药-时曲线并计算得出脂质体包裹的质粒半衰期约为2h，而裸质粒仅为6min。（7）siRNA质粒脂质体的体外药效学研究：Realtime PCR结果显示，与对照组相比，阴性对照组无显著差异；在3μg和6μg剂量时，MDR1基因的mRNA表达水平分别下调33%（P<0.01）和76%（P<0.01），说明siRNA1质粒脂质体能有效的沉默MDR1基因。SRB结果显示，MCF-7/ADR组与NC组细胞抑制率无显著性差异；MCF-7/ADR+siRNA1质粒脂质体组抑制率明显高于MCF-7/ADR组及NC组，具有显著性差异（P＜0.05）。由低浓度到高浓度，细胞对阿霉素的敏感性依次上调10%、6%、14%、23%、44%、28%。（8）siRNA质粒脂质体的体内药效学研究：成功建立了NOD SCID小鼠乳腺癌多药耐药模型。分析整个实验过程测量的小鼠体重和肿瘤体积数据，从小鼠体重方面看，给药后与对照组相比，各组体重均有所减轻，尤其是siRNA质粒脂质体+阿霉素给药组，但各时间点均无统计学差异。从肿瘤体积方面看，与对照组相比，阿霉素组无显著性差异；siRNA质粒脂质体与阿霉素联用组显著抑制肿瘤生长（P＜0.05）。剥瘤后对瘤重的分析结果显示，与对照组相比，阿霉素组无显著性差异；siRNA质粒脂质体与阿霉素联用组显著抑制肿瘤生长（P＜0.05），且抑瘤率远远高于阿霉素组。Realtime PCR检测肿瘤组织中MDR1基因的mRNA表达水平，结果显示，与对照组相比，阿霉素组无显著性差异；siRNA质粒脂质体与阿霉素联用组MDR1基因的表达水平下调53%（P＜0.01）。结论：（1）成功设计筛选出4个能有效抑制MDR1基因表达的siRNA靶点，其中siRNA1干扰效率最高。（2）成功构建了靶向MDR1基因的siRNA表达载体pDual-siRNA1，并制备了siRNA表达载体的阳离子脂质体。（3）siRNA1及其质粒脂质体能有效地沉默MDR1基因，siRNA质粒脂质体与化疗药物联用后能显著抑制乳腺癌细胞和肿瘤的生长，很大程度上逆转乳腺癌的多药耐药。（4）纳米阳离子脂质体是siRNA药物的理想递送载体，能够保护siRNA免于被血浆中的核酸酶降解，并选择性地将siRNA转运到肿瘤区发挥作用。