DNA甲基化具有重要的生物学作用,DNA甲基化位点、甲基化程度分析具有重要意义。论文研究利用DNA重组技术,构建一个能够识别DNA甲基化位点的人工内切酶基因,将重组质粒在大肠杆菌中进行表达,进一步纯化目的蛋白后对该酶的活性进行分析。在分析限制性内切酶BmrⅠ的催化区域和DNA CpG甲基化修复蛋白MBD4结合区域序列的基础上,通过PCR技术分别合成BmrⅠ-linker和linker-MBD4重组片断,采用重叠拼接技术构建BmrⅠ-MBD4重组基因,基因大小为834bp;克隆到表达载体pET-21b(+)中,转化大肠杆菌ER2984,通过蓝白斑及限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切筛选、DNA双脱氧测序,获得含有目的基因的重组质粒阳性克隆。重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3),分别在16℃、30℃、37℃下诱导表达5h,SDS-PAGE检测表明目的蛋白主要以包涵体形式存在;但是降低培养温度,延长诱导表达时间,可提高可溶性重组蛋白的表达量。37℃诱导培养5h后,表达的包涵体目的蛋白采用尿素变性、透析复性,复性酶液通过SP阳离子交换层析,得到进一步纯化,重组蛋白分子量为30213.91Da;分别以来源于大肠杆菌ER2925细胞的pACYC-EagⅠM、pAIT2-CpG M、pUC19质粒为底物进行酶切,琼脂糖电泳显示目的蛋白BmrⅠ-MBD4可降解pAIT2-CpG M和pACYC-EagⅠM质粒,或对两种质粒切口(Nicking),也可能造成质粒聚合;对puC19质粒也显示较低的类似活性。