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猪瘟俗称“烂肠瘟”,是阻碍养猪业发展的重要传染病之一,具有重要的经济意义。该病是猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种严重的猪传染性疾病,以出血热综合征和免疫抑制为特征,在世界范围内造成经济损失。E2是CSFV糖蛋白中最具免疫原性的一种,它能诱导中和抗体来抵御致命病毒的攻击,E2蛋白亚单位疫苗也已应用于CSFV的免疫,但评价E2亚单位疫苗质量的方法还不完善。本研究通过原核表达了 CSFV的E2囊膜糖蛋白,并通过免疫小鼠获得了特异性抗体,为CSFV E2表达产物的鉴定及CSFV的预防和控制提供条件。1.CSFV E2蛋白的克隆与表达E2是CSFV的主要结构糖蛋白之一,是诱导机体产生特异性中和抗体的主要保护性抗原,是病毒进入和免疫的关键决定因素。本研究利用RT-PCR扩增了猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)的E2蛋白(去除跨膜区),并定向克隆到原核表达载体pET-32a,构建成pET-32a-CSFV-E2重组质粒,将测序正确的原核表达重组质粒pET-32a-CSFV-E2转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态,在IPTG终浓度为0.1 mM条件下37℃、225 rpm诱导表达5 h,超声波破碎后取离心后的上清和沉淀分别作SDS-PAGE分析,结果表明在沉淀处有一大小约58 kDa的条带,与融合蛋白大小一致。摸索IPTG最佳诱导浓度,发现在IPTG浓度为0.1 mM时,重组菌沉淀蛋白表达量最高。经Western-blot验证,结果显示重组蛋白与鼠抗His单抗、猪瘟血清均反应,表明其免疫原性较好。E2蛋白原核重组质粒的获得为进一步研制抗E2蛋白单克隆抗体提供了生物材料。2.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的研制为制备针对E2蛋白单克隆抗体,本研究用含原核表达蛋白产物HIS-E2作为免疫原,免疫6～8周龄BALB/c雌性小鼠,每间隔10天免疫一次,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,对免疫效果较好的加强免疫,72～96h后进行细胞融合。将感染CSFV C株的PK15细胞板固定后,对融合成功的杂交瘤细胞上清进行IFA和Western-blot双重筛选,结果获得4株能稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为CSFV-E2-1C2、CSFV-E2-2B2CSFV-E2-3A8、和 CSFV-E2-3H11。经过两次亚克隆,杂交瘤细胞达到100%分泌抗E2蛋白特异性抗体。亚类鉴定结果表明CSFV-E2-1C2、CSFV-E2-3A8 的亚类为 IgG1,CSFV-E2-2B2、CSFV-E2-3H11 的亚类为 IgM,轻链类型均为Kappa链。应用间接免疫荧光方法对对2株单抗腹水进行测效价,结果表明CSFV-E2-1C2腹水效价为1:6400,CSFV-E2-3A8腹水效价为1:12800。通过分段表达E2基因,构建6个E2分段基因的真核重组质粒,分别转入293T细胞中并应用IFA对2株单抗的抗原表位进行分析,结果表明CSFV-E2-1C2、CSFV-E2-3A8分别位于E2蛋白的50-100aa,1-50aa。本研究成功制备了抗CSFV E2蛋白单克隆抗体,为CSFV的生物学研究、检测方法的建立和疫苗质量的评价奠定了基础。