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膜蛋白在生物体的生命活动中不可或缺,主要承担细胞内外环境物质和能量的交换。大多数的药物以膜蛋白为靶点,因此解析膜蛋白的结构对于药物设计起着非常重要的作用。然而膜蛋白由于天然含量低,分离提纯困难以及克隆表达的缺陷等因素导致研究进展缓慢。主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily,MFS)是一个主要的次级膜转运蛋白超家族。由于转运底物的多样性,使得它们在细胞能量代谢和物质交换过程中起重要作用。MFS超家族在低等生物和高等生物中广泛存在,成员众多。由于膜蛋白的结构解析存在很多困难,到目前为止,只有5种MFS蛋白结构被解析清楚,且全部来源于细菌。家蚕中未见该蛋白的相关报道。多角体蛋白(Polyhedrin,Polh)是昆虫杆状病毒感染昆虫后晚期高效表达的一种结构蛋白,分子量约为29kD,其形成的包涵体可在pH10.8以上的缓冲液中溶解。本实验室研究发现,多角体蛋白自N端起的20个氨基酸残基的片段(Ph20)保留了多角体晶体的部分特性,在pH值回调至8.0时融合蛋白依然存在于上清中。利用这种特性,可将外源基因与Ph20基因融合表达,通过调节pH简单纯化目的蛋白。在本实验室家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条ORF为915bp的序列,通过生物信息学分析发现,其编码的蛋白含有304个氨基酸残基,是一个含有六个跨膜区的蛋白,包含一个MFS保守结构域,将其命名为BmMFS。构建重组质粒pET-32a-Ph20-BmMFS,在Ph20和BmMFS基因中间引入凝血酶(Thrombin)酶切位点的核酸序列。转化E.coli Rosetta,1mM IPTG诱导融合蛋白表达。利用Ph20的溶解特性通过调节pH进行初步纯化,镍柱亲和层析进一步纯化,经Westernblotting和质谱鉴定该融合蛋白为Ph20-BmMFS。利用家蚕杆状病毒表达系统构建重组病毒vPh20-BmMFS,感染家蚕BmN细胞,细胞发病后经Western blotting检测,结果显示融合蛋白成功表达。荧光定量PCR结果显示,BmMFS基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平存在明显差异,中肠最高,气管最低。亚细胞定位分析表明,BmMFS蛋白存在于细胞膜上。最后应用RNA干扰技术研究BmMFS基因的功能,结果表明该基因表达沉默后,细胞增殖速度减慢。多角体蛋白片段Ph20基因和膜蛋白基因的融合表达,提高了膜蛋白的表达量,简化了纯化过程,为膜蛋白的结晶创造了条件。