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背景： 肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在所有病理类型中，大约85%是非小细胞肺癌（non-small cell lungcancer, NSCLC）。虽然靶向治疗的出现对肺癌的精准治疗起了巨大的推动作用，但化疗仍是肺癌多学科治疗中应用最广泛的方法。近十余年来，随着化疗方案不断更新与改进，化疗药物耐受已成为困扰肺癌临床治疗的常见难题。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见原因，据估计90%以上因肿瘤死亡的患者，不同程度上都受到化疗耐药的影响。因此，深入研究肺癌细胞对化疗药物发生耐药的分子机制，找出逆转耐药的新靶点和肿瘤治疗的新策略，提高化疗疗效，已成为肺癌临床治疗中亟待解决的关键问题。 本研究小组在先前的研究工作中，首次报道了 cohesin 的装载因子NIPBL （Nipped-B-like）的高表达与NSCLC进展和转移有关，并且高表达的NIPBL往往和肿瘤的低分化以及较差的预后相关。在NSCLC细胞系（NCI-H1299和NCI-H1650）中，降低NIPBL蛋白的表达量对细胞的生物学功能（如增殖，凋亡，迁移和侵袭的能力）有明显的的影响，并且能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。然而，对其中的具体机制并未进行深入的探索。 目的：在先前的研究中，我们发现 NIPBL 表达量的降低可以增加非小细胞肺癌的化疗敏感性，但深层的机制尚未被揭示。本研究通过观察NIPBL敲低的非小细胞肺癌系中，DNA 损伤的表现以及损伤和自噬通路中核心蛋白表达量的改变，提高对NIPBL在非小细胞肺癌DNA损伤和自噬通路中的认识，解释NIPBL增强肺癌细胞化疗敏感性的机制。 方法： 1. p-H2AX荧光检测：细胞在6孔板上按照3×105个/孔的浓度接种，培养过夜使细胞汇合度长至40-50%左右后，用Lipofectamin 3000和siRNA对H1299和H1650细胞进行转染。转染48小时后，用4%的多聚甲醛进行固定， 0.1% Triton X-100破膜，1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）室温封闭1h。接着用抗p-H2AX抗体室温孵育1h，随后加入荧光二抗，暗室条件下孵育50min，再滴加DAPI孵育10min，最后荧光显微镜下观察细胞中p-H2AX灶点的情况并拍摄。 2.彗星实验：将转染48h后的细胞以1×106个/ml的密度和0.65%的低熔点琼脂糖混合，上层再铺 0.8%正常熔点琼脂糖。细胞放入消化液裂解后，平放于水平电泳槽中，300mA，20V条件下电泳40min，最后滴上Gelred在荧光显微镜下观察并拍摄。 3.蛋白质谱检测：细胞转染48h后置于含Tris的脱氧胆酸钠（Tris-sodium deoxycholate, SDC）溶液中裂解，将裂解产物和二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）混合，60℃放置20min，加入碘代乙酰胺（iodoacetamide, IAA）避光静置30min，随后加入脱氧胆酸钠和质谱级胰酶消化过夜。将溶液和三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）混合，取上层溶液经C18柱脱盐后真空干燥，加入甲酸溶液（formic acid, FA）重溶，最后，取上清25μl进样，将数据放入DAVID生物信息库分析。 结果： 彗星实验提示在H1299细胞中，用两种siRNA将NIPBL敲低后，细胞彗星尾部 DNA 百分比分别为 18.58±8.91%和 11.00±5.99%，而正常细胞为4.18±2.58%；H1650细胞中这三个细胞彗尾DNA百分比分别为18.45±7.80%， 13.78±6.97%和8.78±3.27%，结果显示NIPBL表达量的下降导致彗星尾部DNA百分比明显增高。此外，p-H2AX灶点作为双链断裂的标志，在NIPBL敲低后， p-H2AX 灶点的数量比对照组细胞明显升高，H1299 敲低株中灶点数量分别为19.13±1.87和14.44±1.98个，相较于正常细胞3.09±0.96个灶点有明显的升高；H1650相应的灶点数量为18.21±2.79,14.33±1.19和7.38±1.48个，用western blot实验对蛋白水平的测定同样也显示p-H2AX的表达量在NIPBL低表达的细胞中含量更高。ATM、ATR、Ku70和Ku80这些DNA损伤应答中的核心蛋白在NIPBL敲低后表达量发生明显下调，说明了NIPBL敲低后影响了细胞对损伤的应答反应。在此基础上，我们还初步探索了 NIPBL 和自噬途径的关系：NIPBL表达下调，LC3-B的表达量上升，而p53，p62和p-mTOR的表达量均有不同程度的下降，提示敲除NIPBL会诱导自噬的增强。最后，为了更全面地了解NIPBL的功能，利用质谱分析技术和DAVID生物信息库，我们得到了8个蛋白，它们在两株细胞敲除前后有 1.5倍以上的改变，我们挑选了两个（MSH2和 STAT1）和 DNA 损伤修复关系比较密切的蛋白进行验证，同样发现 NIPBL 敲除会明显影响以上蛋白的表达。 结论： NIPBL作为cohesin复合体的装载因子，不仅在姐妹染色单体结合的过程中发挥重要作用，在DNA损伤和自噬途径中也占据了重要地位。本实验证明，敲除NIPBL后，DNA损伤应答反应受到明显的抑制，而自噬途径得到加强。希望本实验中对 NIPBL 的进一步研究能为肺癌的精准治疗提供新的靶点，为寻找新的损伤修复抑制剂并用于非小细胞肺癌的治疗提供坚实的理论基础。