研究背景及目的：阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，Tv)是一种单细胞真核生物型原虫，寄生于人体泌尿生殖道，可引起阴道毛滴虫病(Trichomoniasis)。阴道毛滴虫病已被列为人类常见性传播疾病之一。据不完全统计，世界每年约有1亿2千万患者，随着世界各地流动人口的增加，滴虫感染率呈逐年上升趋势。研究发现，阴道毛滴虫的感染可增加人体对其它病原体(如人类免疫缺陷病毒)的易感性，故受到越来越多的关注。阴道毛滴虫对人体泌尿生殖道靶上皮细胞的黏附是虫体感染的关键环节，而这一环节是黏附分子(adhesion protein，AP)介导的接触依赖性过程。就目前的研究而言，滴虫细胞表面有4种黏附分子参与了这一过程，分别是AP23，AP33，AP51，AP65。AP33蛋白是定位于细胞膜上非常重要的一种黏附分子，从其分子结构来看，N-末端约72个氨基酸的区域和C-末端24个氨基酸的区域可以和宿主细胞相互反应，介导了滴虫的黏附，用抗滴虫的mAb主要与AP33蛋白C-末端约28个氨基酸区域有免疫反应性，该研究证明了AP33蛋白的黏附作用及免疫反应性的存在。该蛋白由AP33蛋白基因编码，为单拷贝基因，存在3种类型，分别为ap33-1，ap33-2，ap33-3，该基因在序列上有很大的保守性，已有研究表明：该基因是一种较好的遗传标志。阴道毛滴虫在长期的生物进化过程中，形成不同种、亚种和不同株，不同分离株在遗传上具有不同的特征，在此基础上，阴道毛滴虫与宿主相互作用过程中可形成不同的表型。临床上滴虫感染者可表现为滴虫病、带虫者等多种情况。国内外很多学者对两株滴虫进行分离培养并进行动物和细胞学实验，均证实两株滴虫在致病力上存在一定的差异，而表型的差异是由基因的差异所引起的，ap33基因作为一种较好的遗传学标志可为比较两株滴虫基因是否存在差异提供参考。研究ap33基因的克隆、序列比较及表达有利于进一步研究AP33蛋白的结构和功能，认清阴道毛滴虫的致病机制，为滴虫的防治打下理论基础，也可为种内亚型提供理论依据。本研究分两部分：第一部分：目的有症状株及无症状株黏附蛋白33基因的克隆和序列比较。方法分离和培养我国四川地区阴道毛滴虫有症状株(阴道毛滴虫四川分离株-2)及无症状株(阴道毛滴虫四川分离株-3)，有机法提取滴虫基因组DNA，根据GenBank上提供的ap33基因序列，设计3对特异性引物，以DNA为模板，对滴虫四川分离株ap33基因进行PCR预扩增，确定ap33基因类型，再行特定ap33基因大量扩增，纯化后克隆入PMD-18T线性载体，PCR法及限制性酶切法对重组质粒进行鉴定，并对ap33基因进行序列测定和比较。结果我们成功构建ap33基因克隆载体，经鉴定和序列测定，四川地区阴道毛滴虫有症状株及无症状株的ap33基因类型均为ap33-1，编码区全长930 bp，与国际标准株的同源性均达到99％，两株滴虫ap33基因存在3对碱基的差异。第二部分：目的构建ap33基因原核表达质粒并诱导表达，构建真核表达质粒。方法将含有第一部分构建的滴虫有症状株重组质粒pMD-18T-ap33及pUC18、pcDNA3-1(+)的甘油保种菌液划线接种于固体培养基，挑取单菌落接种于液体培养基，37℃振荡培养过夜后，用日常型质粒提取试剂盒分别提取3种质粒，分别对3种质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，切胶，DNA纯化试剂盒纯化回收所需DNA片段，将ap33基因片段定向克隆入pUC18、pcDNA3.1(+)载体中，重组质粒经PCR及双酶切鉴定。重组质粒pUC18-ap33经IPTG诱导，采用SDS-PAGE电泳及Western-blot方法鉴定蛋白质表达情况。结果经PCR及酶切鉴定，重组质粒pUC18-ap33、pcDNA3.1(+)-ap33为正确重组子。pUC18-ap33经IPTG诱导表达出约Mr 36 000大小的蛋白质，与理论值相符。结论在本研究中，我们成功分离出阴道毛滴虫有症状及无症状株，在此基础上，对黏附蛋白33基因进行了克隆和序列测定，分别比较两株滴虫ap33序列与国际标准株之间的同源性，同时比较了两株间的差异，为比较有症状及无症状在基因水平上的差异，从而为种内亚型提供数据准备。同时进行了有症状株黏附蛋白33基因原核和真核表达载体的构建，并在IPTG的诱导下表达出蛋白质，为研究阴道毛滴虫的黏附及致病机制，从而为滴虫病的防治打下理论基础。