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我国有丰富的肉桂油资源,广泛应用于医药、食品等领域。肉桂油的主要成分是肉桂醛和肉桂酸。本文以肉桂醛及肉桂酸为起始底物,开展了基于“C=C”键和“C=O”键的微生物转化反应研究,制备了一系列的天然香料和手性1-苯乙醇。主要研究内容和取得的成果如下:
1.采用含富集培养的方式对土壤中进行了大量的能耐受肉桂醛菌株的筛选,得到了16株能将肉桂醛转化为苯甲醛的菌株(苯甲醛含量＞5％),其中菌株JX-93的转化能力最强;得到了10株能将肉桂醛转化为肉桂醇的菌株(肉桂醇含量＞20％),其中菌株JX-23的转化能力最强;经形态鉴定及ITS序列与NCBI数据库进行比对,鉴定为毛霉(Mucorsp.),命名为Mucorsp.JX-23。对JX-23代谢的酶系进行初步研究,JX-23产生的氧化还原酶是诱导型的胞内酶,当分别添加肉桂醛、肉桂酸、苯乙酮为催化底物时,JX-23能分别将底物高选择性地转化为肉桂醇、苯乙酮、1-苯乙醇。
采用富集培养的方式对土壤中进行了大量的能耐受肉桂酸菌株的筛选,得到了一株能将肉桂酸高效、高选择性转化为苯乙酮的菌株JX-66。将该菌株的16SrRNA序列与NCBI数据库进行比对,JX-66鉴定为伯克氏菌(Burkholderiasp.),命名为Burkholderiasp.JX-66。
用含苯乙酮的富集培养基从土壤中筛选到菌株IS118可以将苯乙酮不对称还原为(R)-1-苯乙醇。将该菌株的18rDNA序列与NCBI数据库进行比对,IS118鉴定为溜曲霉(Asperillustamarii),命名为AsperillustamariiIS118。
用含1-苯乙醇的富集培养基从土壤中筛选到菌株S307可选择性的氧化消旋1-PEA中的(S)-1-PEA为苯乙酮,实现(D,L)-1-苯乙醇的氧化拆分。经16SrRNA基因序列比对,该菌株确定为草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)Undibacterium属的一个种,命名为Undibacteriumsp.S307。
2.进行JX-93转化肉桂醛为苯甲醛的研究,开拓了制备天然苯甲醛新方法。
对菌株JX-93进行浓度梯度驯化培养,得到驯化菌株JX-93ⅡB。以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、在pH为6.0,30℃的条件下培养JX-93ⅡB48h后,加入肉桂醛2g/L,30℃,有氧条件下转化3天,产物中苯甲醛的含量提高到20％以上。
3.利用Mucorsp.JX-23催化肉桂醛高选择性生物还原加氢制备肉桂醇,实现了温和条件下“C=C”选择加氢的新方法。
以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、在pH为6.0,30℃的条件下培养Mucorsp.JX-2348h后,加入0.5g·L-1吐温-80,然后按分3次添加肉桂醛至总浓度为4.0g/L,pH=6.0,30℃,180rpm条件下转化72h,肉桂醛的转化率达到最高83.1％,生成肉桂醇的选择性为88.0％。转化液中肉桂醇的总浓度达到2.9g/L。
4.肉桂酸生物降解合成苯乙酮的工艺条件优化,为具有实用价值的、高浓度、高转化率和高选择性的合成提供实验基础。
Mucorsp.JX-23在以葡萄糖为碳源,蛋白胨为氮源的培养基中发酵培养48h后,将溶解在乙醇中的肉桂酸分三次添加到发酵液中,使其总浓度为6.0g/L,在pH=6.0,30℃,180rpm的条件下转化48h,肉桂酸的转化率可达到81％,转化液中苯乙酮的含量达到3.8g/L。
Burkholderiasp.JX-66在以蔗糖为碳源,牛肉膏为氮源的培养基中发酵培养48h后,将溶解在乙醇中的肉桂酸分三次添加到发酵液中,使其总浓度为6.0g/L,在pH=9.0,30℃,180rpm的条件下转化48h,肉桂酸的转化率可达到74％,转化液中苯乙酮的含量达到3.3g/L。
5.微生物催化苯乙酮不对称还原合成手性苯乙醇,为手性苯乙醇的合成提供一种新途径。
Mucorsp.JX23催化苯乙酮不对称还原为(S)-1-苯乙醇。在底物浓度为3.0g/L,体系pH为7.0的条件下,30℃反应54h,(S)-1-苯乙醇的浓度达到2.3g/L,产率为77％,e.e.值为89％。
AsperillustamariiIS118催化苯乙酮不对称还原为(R)-1-苯乙醇。在底物浓度为2.0g/L,体系pH为7.0的条件下反应3天,(R)-1-苯乙醇的浓度达到1.4g/L,e.e.值为91％。
6.建立了Undibacteriumsp.S307催化氧化拆分与AsperillustamariiIS118催化不对称还原耦联,进行消旋1-PEA去消旋化制备高纯度的(R)-1-苯乙醇的新方法。
顺序使用两种微生物发酵液同底物反应:Undibacteriumsp.S307发酵培养48h后,添加消旋1-苯乙醇,使其浓度为4.0g/L。自然pH,30℃,180rpm,摇瓶转化48h,得到的氧化拆分产物直接加入AsperillustamariiIS118发酵液,转化转化92h。反应结束后,反应体系中(R)-1-PEA含量＞99％,(R)-1-苯乙醇的得率为87％。