研究背景和目的:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤,其发病率高居全球各类肿瘤第3位。随着人口老龄化、生活方式和饮食结构的改变,全世界结直肠癌的发病率以每年2%的速度递增,而中国的增速则为3.9%,明显高于世界平均水平。癌细胞转移是引起结直肠癌患者死亡的首要原因,据统计,临床上有超过50%的结直肠癌患者死于转移相关的并发症。肝脏是结直肠癌较先和较易侵袭的器官,约25%的患者在初诊时即发现结直肠癌肝转移,而初诊未发现转移灶的患者在后续治疗过程中逐步发展为肝转移的概率较高。结直肠癌严重影响了人们的生活质量、危害了患者的生命健康。因此,深入探讨结直肠癌发生发展和转移的分子机制具有一定的科学意义和社会价值。结直肠癌的发生发展和转移是一个非常复杂的过程,其具体机制目前尚不完全清楚。肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段、多基因参与的生物学过程,此过程包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活或丢失、凋亡调节基因和DNA修复基因功能紊乱,以及近年来认识到的微小RNA调节紊乱等。肿瘤转移的过程比较复杂,概括而言即癌细胞从肿瘤的原发部位脱离,侵袭周围的基质,进入循环,粘附在血管内壁并向血管外迁移,进而在远处种植,以致形成新的转移灶。结直肠癌转移的机制十分复杂,主要涉及肿瘤细胞之间的解粘附、细胞骨架改变、上皮间质转化、细胞外基质的降解、肿瘤微环境的变化、肿瘤细胞的迁移和运动能力的改变等。目前关于结直肠癌发生发展和转移的的分子机制尚未完全清楚。因此,深入研究结直肠癌的发生发展和侵袭转移的分子机制,可为结直肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。EPB41L5(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 5)又名 BE37、YMO1,定位于人染色体2q14.2。EPB41L5是2007年11月首次发现的与细胞骨架及细胞运动相关的蛋白,在哺乳动物的胚胎中胚层和内胚层上皮组织中广泛表达。EPB41L5属于4.1蛋白家族,其N端有一个FERM结构域。EPB41L5参与调节许多重要的生物学过程,包括细胞肌动蛋白骨架、细胞粘附分子、EMT、基底膜形成以及细胞极性形成等过程。研究显示,EPB41L5所含的FERM结构域能与含MyTh4(myosin tail homology 4)结构域的myosins蛋白交联,参与调控细胞伪足形成及细胞运动,并能与细胞骨架蛋白Talinl、PTK等结合,调节细胞肌动蛋白骨架。Hirano的研究表明,EPB41L5过表达后可通过其FERM结构域的作用使细胞膜表面E-cadherin减少,从而促进EMT过程。Gosens发现,CRB-MPP5-EPB41L5复合物可调控多种细胞粘附因子,对细胞间紧密连接和细胞极性的形成起重要作用,并与上皮细胞极性和基底膜形成有密切关联。近期的研究表明,Arf6-EPB41L5-AMAP1的复合体可促进肾癌对间质侵袭浸润。在前期工作中,我们通过全基因组表达谱芯片筛选发现EPB41L5为结直肠癌的相关差异表达基因,而且EPB41L5在结直肠癌组织中表达升高。同时我们还发现EPB41L5的高表达可能与结直肠癌的发生发展和侵袭转移相关。然而,目前关于EPB41L5表达失调对结直肠癌侵袭转移的影响及其分子机制尚不清楚。本课题检测了 EPB41L5在结直肠癌组织和细胞中的表达情况,分析其表达与相关临床病理特征之间的关系,并通过多种实验研究EPB41L5的表达失调对结直肠癌细胞生物学特性的影响,同时探讨其发挥生物学功能的分子机制。方法:1.运用公共数据库数据(GEO数据库、CCLE数据库)的数据,分析结直肠癌及其他恶性肿瘤中EPB41L5的表达及其与结直肠癌侵袭转移的关系。2.运用免疫组织化学、实时定量荧光PCR和western blot实验检测EPB41L5在结直肠癌及配对正常肠粘膜组织中的表达,并分析了 EPB41L5的表达与临床病理特征之间关系。3.运用慢病毒感染的方法构建EPB41L5稳定过表达细胞株(SW480/FLAG-EPB41L5)和对照细胞株(SW480/PSIN)以及(HCT15/FLAG-EPB41L5)和对照细胞株(HCT15/PSIN);EPB41L5 沉默细胞株(SW620/shRNA2)、(SW620/shRNA3)和对照细胞株(SW620/GV248)以及(LOVO/shRNA2)、(LOVO/shRNA3)和对照细胞株(LOVO/GV248);4.运用MTT、平板克隆实验、Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测EPB41L5对细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;5.运用Western blot检测EPB41L5的过表达和干扰后对结直肠癌细胞EMT相关标志物表达的影响;6.运用公共数据库数据(GEO数据库、Pre-PPI数据库),通过GSEA基因富集的方法及DAVID检索软件分析与EPB41L5表达上调相关的信号通路及蛋白;7.运用Western blot和细胞免疫荧光检测EPB41L5过表达和干扰后对对结直肠癌细胞中Racl信号通路及细胞骨架的影响;8.运用Western blot、RT-PCR、TOP/FOP双荧光素酶报告基因实验和细胞免疫荧光实验检测EPB41L5-Racl对结直肠癌细胞中Wnt信号通路的影响9.运用SPSS 20.0软件对实验结果进行统计学分析。使用配对t检验分析免疫组织化学法及实时定量荧光PCR法中癌组织和相对正常组织的结果;使用两独立样本t检验法分析Transwell小室侵袭实验、划痕愈合实验、平板克隆实验;使用χ2检验、Fisher确切概率法或KruskalwallisH检验分析分类资料,使用Spearman(双向)秩相关检验进行相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.EPB41L5在结直肠癌组织中的表达情况1)公共数据库CCLE中EPB41L5在结直肠癌和其他恶性肿瘤中的表达和突变情况运用公共数据库 Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)和 cBioPortal for Cancer Genomics在线检索软件的相关数据分析了 EPB41L5在结直肠癌和其他恶性肿瘤中的表达和突变情况。结果显示,EB41L5在急性淋巴细胞白血病、前列腺癌、小细胞肺癌和结直肠癌中的表达较高,并且在3个结直肠癌相关的数据库显示EPB41L5发生了基因突变。2)公共数据库中EPB41L5在结直肠癌中的表达与相关基因的富集情况通过GSEA基因富集方法分析GEO数据库中与结直肠癌相关的基因芯片数据。结果显示,EPB41L5的表达在正常肠癌组织、原位癌、转移癌中依次升高,并且两两之间比较差异有统计学意义(p<0.05)。3)公共数据库中EPB41L5的表达与结直肠癌转移之间的关系运用GSEA基因富集分析方法,分析GEO数据库中转移性结直肠癌组织相关的表达谱芯片数据,数据结果表明转移癌相对于正常组织低表达的基因“RICKMAN METASTASIS DN”在EPB41L5低表达组中上调且显著富集(P<0.05),;另一组转移癌相对于正常组织高表达的基因“RICKMAN METASTASIS UP”在EPB41L5高表达组中上调且显著富集(p<0.05),提示EPB41L5高表达可促进癌症转移。4)结直肠癌组织中EPB41L5表达水平的检测RT-PCR实验、免疫组织化学和western blot实验检测结直肠癌组织和配对正常组织中EPB41L5的表达情况。western blot和RT-PCR实验结果显示,结直肠癌组织中EPB41L5的mRNA和蛋白表达水平均高于相应配对的癌旁正常结直肠黏膜组织(P<0.05);免疫组织化学检测结果显示,EPB41L5主要在结直肠癌细胞的胞膜和胞浆中阳性表达,呈黄褐色或棕红色,并且在肿瘤组织中的表达水平明显高于相应配对的癌旁正常结直肠组织,并且随着分化程度的降低、Ducks分期的升高和转移的发生,EPB41L5的表达水平明显升高(P<0.05)。5)EPB41L5表达水平与临床病理参数之间的关系EPB41L5的表达水平在不同年龄组、不同性别和浸润程度(T)之间没有显著差异(P>0.05);EPB41L5的表达水平在不同分化程度的结直肠癌之间存在具有统计学意义的差异,并且随着EPB41L5表达水平的升高分化程度越差,相应地EPB41L5表达水平越低分化程度越高(P<0.05);EPB41L5的表达水平与不同组织类型之间的差异有统计学意义,EP41L5在预后较差、恶性程度更高的粘液腺癌中的表达比腺癌中的表达更高(P<0.05);此外,EPB41L5的表达水平在不同Dukes分期、NM分期及预后之间具有统计学意义的差异,随着Dukes分期、淋巴结转移数量(N)以远处转移(M)的升高,EPB41L5的表达水平逐渐升高(P<0.05)。同时在130例结直肠癌患者以及Ducks分期在C-D和T分期在3-4的患者中,EPB41L5高表达组的总体生存率显著高于低表达组,随着EPB41L5表达的升高,总体生存曲线逐渐下降(P<0.05)。2.EPB41L5在结直肠发生发展及侵侵袭转移中的作用1)建立EPB41L5稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株首先利用western blot和RT-PCR检测了 7株结直肠癌细胞株中EPB41L5的表达水平,结果显示,SW620、LOVO细胞株中EPB41L5的表达水平相对较高,而SW480和HCT15细胞株中EPB41L5的表达水平相对较低。因此,在后续的实验中,我们采用慢病毒感染的方法利用SW620和LOVO细胞构建了 EPB41L5稳定干扰细胞株,利用SW480和HCT15构建了 EPB41L5稳定过表达细胞株,并运用western blot实验进行了验证。2)EPB41L5稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞增殖能力的影响使用MTT实验、平板克隆形成实验检测EPB41L5对结直肠癌细胞增殖能力的影响。MTT实验结果显示,与对照组相比EPB41L5稳定过表达的细胞生长速度显著升高(P<0.05),EPB41L5被干扰的细胞株的生长速度显著慢于对照组(P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,与对照组相比EPB41L5稳定过表达细胞形成的克隆数量显著增加(P<0.05),EPB41L5被干扰的细胞株形成的克隆数量显著少于对照组(P<0.05)。3)EPB41L5稳定过表达和干扰对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响使用Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测EPB41L5对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达EPB41L5的细胞株迁移细胞的数量明显增多(P<0.05),而EPB41L5被干扰的细胞株迁移细胞的数量则显著减少(P<0.05)。划痕实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达EPB41L5的细胞株迁移速度明显加快,而EPB41L5干扰细胞株细胞迁移的速度则显著减慢。4)EPB41L5过表达和干扰对结直肠癌细胞中EMT相关标志物表达水平的影响western blot实验结果表明,与对照组相比,过表达EPB41L5之后SW480细胞上皮标志物E-cadherin表达显著降低,而间质分子标志物Vimentin的表达显著升高;相反,与对照组相比,干扰EPB41L5之后在SW620细胞株上皮标志物E-cadherin表达显著升高,而间质分子标志物Vimentin的表达显著降低。3.EPB41L5在结直肠癌进发生发展及侵袭转移中的作用机制1)结直肠癌中与EPB41L5高表达相关的信号通路的分析运用Pre-PPI数据库、GEO数据库分析结直肠癌中与EPB41L5高表达的相关的信号通路。数据显示,在Pre-PPI数据库中,与EPB41L5相互作用的蛋白富集在黏着斑、细胞骨架调控通路、结直肠癌、Wnt信号通路等信号通路中。同时,在基因芯片GSE17536数据中与细胞骨架相关的基因集“CORTICAL CYTOSKELETON”、“MICROTUBLE CYTOSKELETON”和“RAC1 REG PATHWAY”基因集在EPB41L5高表达组中上调并且显著富集(ES=-0.5,ES=-0.61,P<0.05),并且在基因芯片GSE13294中与Wnt信号通路相关的基因集“WNT BATA CATENIN PATHWAY”在EPB41L5高表达组中上调并且显著富集(ES=-0.48,ES=-0.51,P<0.05)。2)EPB41L5对Rac1的活性及下游信号通路靶基因的调节作用利用westemblot实验验检测EPB41L5过表达和干扰后Rac1信号通路下游的变化,验证EPB41L5对Racl活性的调节作用。结果显示,与对照组相比,在结直肠癌细胞株SW480中过表达EPB41L5后,Racl-GTP的表达显著增加,同时Rac1通路的下游信号分子 PAK、P-PAK、LIMK、P-LIMK、cortactin、P-cortactin、WAVE2和WAVE3的表达也相应升高;相反,在SW620中干扰EPB41L5后,Rac1-GTP的表达显著降低,同时Racl通路的下游信号分子PAK、P-PAK、LIMK、P-LIMK、cortactin、P-cortactin、WAVE2 和 WAVE3 的表达也相应降低。3)EPB41L5对结直肠癌细胞的形态和骨架的影响运用细胞免疫荧光实验观察EPB41L5过表达和干扰后结直肠癌细胞株细胞的形态和伪足的变化。实验结果显示,与对照组相比,过表达EPB41L5后SW480和HCT15细胞形态转变为梭形且细胞伸出较多的伪足;相反,干扰EPB41L5后SW620和LOVO形态转变为圆形,细胞的片状伪足与对照组相比显著减少。4)EPB41L5-Rac1对结直肠癌细胞中Wnt信号通路的影响运用生物信息学、western blot实验、RT-PCR实验、TOP/FOP双荧光素酶基因报告试验和细胞免疫荧光实验检测EPB41L5干扰和过表达对结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的作用。生物信息学结果显示,Wnt/β-catenin信号通路相关基因在EPB41L5高表达组富集(ES=-0.51,P<0.05)。TOP/FOP双荧光素酶基因报告试验结果显示,与对照组相比,过表达EPB41L5后结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性显著升高,干扰EPB41L5后结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性明显降低。western blot实验、RT-PCR实验和细胞免疫荧光实验结果显示,与对照组相比,EPB41L5过表达后可显著上调c-Myc,CyclinD1,β-catenin的表达,并且β-catenin入核增加。相反,EPB41L5被干扰后结直肠癌细胞SW620中c-Myc,CyclinD1,β-catenin的表达明显下降,并且β-catenin入核减少。结论:1.EPB41L5在结直肠癌组织中表达水平显著上调,并且其表达水平与结直肠癌肿瘤类型、Dukes分期、转移及预后等临床病理参数之间呈正相关关系。2.EPB41L5过表达能够促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移,而干扰EPB41L5后则可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。3.EPB41L5参与调控Rac1的活化,并调节Wnt信号通路的活性、参与EMT进程和细胞骨架的重构。