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目的本研究旨在探讨GRP78在卵巢癌顺铂耐药中的作用及其作用机制,为探索有效逆转卵巢癌顺铂耐药提供新靶点与新思路。方法本研究应用RT-PCR法及Western免疫印迹法检测卵巢癌细胞株SKOV3和SKOV3/DDP细胞中GRP78及其蛋白表达水平；以GRP78调节因子BAPTA-AM、A23187分别下调、上调卵巢癌细胞中GRP78表达,以RT-PCR法及Western免疫印迹法检测卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞中GRP78、PI3K、AKT、p-AKT mRNA及其蛋白表达水平改变；以MTT法检测顺铂对SKOV3及SKOV3/DDP细胞生长抑制率,并确定BAPTA-AM.A23187对卵巢癌顺铂化疗敏感性的影响；采用流式细胞技术分析GRP78调节因子在顺铂对卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞凋亡水平及其周期分布特点的影响,从而确定GRP78在卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用及其作用机制。结果1.卵巢癌细胞中GRP78表达及其与顺铂敏感性的关系：GRP78在SKOV3细胞及SKOV3/DDP细胞中均有表达,但SKOV3/DDP细胞中GRP78mRNA及其蛋白表达水平均高于SKOV3细胞。其中GRP78mRNA相对表达强度分别为：SKOV3细胞(0.5464±0.04048)、SKOV3/DDP细胞(0.7267±0.05508),两组细胞比较差异有统计学意义(t=0.01,P<0.05)。GRP78蛋白相对表达强度分别为：SKOV3细胞(0.4937±0.03147)、SKOV3/DDP细胞(0.6913±0.05633),两组细胞比较差异有统计学意义(t=5.304,P=0.006<0.05)。可见GRP78表达增高与卵巢癌顺铂耐药有关。2.调节卵巢癌细胞GRP78表达对肿瘤细胞顺铂敏感性的影响：以BAPTA-AM处理SKOV3和SKOV3/DDP细胞,肿瘤细胞GRP78mRNA及其蛋白表达水平均下降,相对表达强度分别为SKOV3细胞(0.3200±0.01000)、(0.3100±0.02000),SKOV3/DDP细胞为(0.4400±0.03464)、(0.3500±0.04000),对照组GRP78mRNA及蛋白表达水平分别为SKOV3细胞(0.5133±0.03512)、(0.5033±0.03215)；SKOV3/DDP细胞为(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506),两组相比差异有统计学意义(SKOV3细胞t=8.286,P=0.014；t=6.526,P=0.023；SKOV3/DDP细胞t=9.127,P=0.012;t=5.130,P=0.036)。经A23187处理SKOV3和SKOV3/DDP细胞, GRP78mRN A及其蛋白表达水平均增加,分别为SKOV3细胞(0.7600±0.07211)、(0.7233士0.03512),SKOV3/DDP细胞(0.8733±0.03786)、(0.8500±0.02646),与对照组GRP78mRNA及蛋白表达水平[SKOV3细胞(0.5133士0.03512)、(0.5033±0.03215);SKOV3/DDP细胞为(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506)]相比差异有统计学意义(t=5.615,P=0.030；；t=4.778,P=0.041)。SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞经BAPTA-AM药物作用后GRP78表达水平下降,而肿瘤细胞对DDP敏感性分别增加了37.15%、52.91%。但是经A23187药物作用后,肿瘤细胞GRP78表达水平增加,其对DDP敏感性分别降低了54.86%、27.72%。推测GRP78表达水平增高与卵巢癌顺铂耐药性有关,下调GRP78表达能够增强卵巢癌顺铂敏感性。3.调节GRP78对SKOV3、SKOV3/DDP细胞PI3K、AKT、p-AKT表达的影响(1)经BAPTA-AM下调GRP78表达后,肿瘤细胞中PI3K、AKTmRNA相对表达水平分别下降为SKOV3细胞(0.2600±0.03606)、(0.3867+0.04041)；SKOV3/DDP细胞(0.3767±0.03055)、(0.4500±0.0100),对照组PI3K、AKTmRNA相对表达水平分别为SKOV3细胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512)；SKOV3/DDP细胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528),经统计学分析,差异有统计学意义(SKOV3细胞t=8.082,P=0.015;t=23.000, P=0.002;SKOV3/DDP细胞t=12.618,P=0.006；t=17.665,P=0.003)。经BAPTA-AM下调GRP78表达后,两种细胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平分别下降为SKOV3细胞(0.4033±0.04163)、(0.3611±0.03464)、(0.3600±0.04359); SKOV3/DDP细胞(0.4933±0.02517)、(0.5000±0.04163)、(0.4267±0.04041),对照组PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平分别为SKOV3细胞(0.5267±0.04726)、(0.5433±0.04619)、(0.4600±0.0100)；SKOV3/DDP细胞(0.6500±0.03606)、(0.6800±0.02646)、(0.5767±0.03215),经统计学分析,差异有统计学意义(SKOV3细胞t=10.262,P=0.009；t=27.5,P=0.001；t=5.000,P=0.038);SKOV3/DDP细胞(t=17.764,P=0.003；t=-4.750,P=0.042；t=12.990,P=0.006)。(2)经A23187上调GRP78后,肿瘤细胞中PI3K、AKTmRNA表达水平分别升高,它们相对表达量为SKOV3细胞(0.6867+0.02082)、(0.7200±0.01732)；SKOV3/DDP细胞(0.7467±0.04041)、(0.8467±0.03055),对照组PI3K、AKTmRNA相对表达水平分别为SKOV3细胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512)；SKOV3/DDP细胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528),经统计学分析,差异有统计学意义(SKOV3细胞t=1.529,P=0.017;t=7.750,P=0.016;SKOV3/DDP细胞t=5.518,P=0.031；t9.165,P=0.012)。经A23187上调GRP78后,两种细胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平也都升高,其相对表达量为SKOV3细胞(0.6633±0.07506)、(0.6567±0.03512)、(0.5367±0.03055);SKOV3/DDP细胞(0.7200±0.03000)、(0.8300±0.04000)、(0.6900±0.02000),对照组PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达水平分别为SKOV3细胞(0.5267±0.04726)、(0.5433±0.04619)、(0.4600±0.0100)；SKOV3/DDP细胞(0.6500±0.03606)、(0.6800±0.02646)、(0.5767±0.03215),经统计学分析,差异有统计学意义(SKOV3细胞t=4.799,P=0.041；t=9.430,P=0.011；t=-4.6,P=0.044;SKOV3/DDP细胞t=4.583,P=0.044；t=15,P=0.004；t=9.430,P=0.011)。可见GRP78可调节PI3K、AKT、p-AKT的表达。推测GRP78可能通过PI3K/AKT信号转导通路参与卵巢癌顺铂耐药。4.调节GRP78对SKOV3、SKOV3/DDP细胞凋亡及细胞周期的影响：经BAPTA-AM下调GRP78表达后,SKOV3及SKOV3/DDP细胞的凋亡率(27.42%,21.91%)较对照组(19.57%,12.74%)增加；经A23187上调GRP78表达后,SKOV3及SKOV3/DDP两种细胞的凋亡率(12.21%,7.22%)较对照组(19.57%,12.74%)降低,且敏感株SKOV3细胞凋亡率比SKOV3/DDP细胞凋亡率高。在两种细胞中,随着GRP78表达的降低,G1期细胞比率逐渐增高,S期及G2期细胞比率则逐渐减少,推测GRP78表达降低可导致细胞SK0V3及SK0V3/DDP细胞G1期阻滞,从而增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用。结论1.GRP78表达增高与上皮性卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞顺铂耐药有关,下调GRP78表达可增强卵巢癌顺铂敏感性,GRP78可能成为逆转卵巢癌顺铂耐药的新靶点。2.GRP78可能通过调节PI3K/AKT信号转导通路、抗肿瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞等途径参与卵巢癌顺铂耐药。