论文部分内容阅读
目的:本研究将三株不同侵袭性的肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402、HepG2分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)LX2细胞transwell共培养,论证肝癌微环境中 TGFβ1(transforming growth factor betal,TGFβ1)可以促进 LX2 细胞向肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)转化,LX2细胞转化为CAFs后促进肝癌细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),最终促进肝癌细胞的侵袭和迁移。研究结果将为探讨HSCs以及TGFβ1对肝癌细胞侵袭迁移的影响提供实验依据,并为寻找肝癌治疗新靶标提供方向。方法:①LX2细胞与肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分别共培养,观察LX2细胞形态变化。用TGFβ1刺激LX2细胞,观察LX2细胞形态改变。②不同浓度的TGFβ1及其抑制剂SB525334处理单独培养以及与肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)共培养的 LX2 细胞,RT-PCR 检测 CAFs相关分子α-SMA、FAP、Desmin等mRNA表达水平的变化;Westerm Blot检测α-SMA、FAP、Desmin蛋白表达水平的变化;③不同浓度TGF[β1及其抑制剂处理单独培养以及与LX2细胞共培养的肝癌细胞BEL-7402,Transwell迁移实验及侵袭实验检测单独培养和与LX2细胞共培养的肝癌细胞BEL-7402迁移侵袭能力的变化;④不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理单独培养和与LX2细胞共培养的肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2),实时定量 RT-PCR 检测肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)EMT相关分子E-cadherin、vimentin等 mRNA表达水平的变化;Western Blot检测E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平的变化;⑤不同浓度TGFβl及其抑制剂处理单独培养和与LX2细胞共培养的肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2),实时定量 RT-PCR 检测肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)中侵袭转移相关分子 EGF、VEGF、MMPs mRNA表达水平的变化;Western Blot检测MMP2、VEGF蛋白表达水平的变化。结果:①LX2细胞与肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分别共培养48h或者TGFβ1刺激后,其形态发生变化,由星形或多边形转变为纺锤形、扁平长梭形,细胞呈两极生长,细胞突触明显减少;②LX2细胞与肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)分别共培养48 h后,在mRNA水平,其CAFs相关分子α-SMA或FAP的表达显著升高。不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理单独培养以及与肝癌细胞共培养的LX2后,TGFβ1可以显著促进α-SMA、FAP在基因水平的表达,其效应可以被TGFβ1抑制剂所取消;在蛋白水平,TGFβ1可以显著促进α-SMA、Desmin、FAP的表达,抑制剂可以取消TGFβ1的作用;③与LX2细胞共培养后,BEL-7402细胞的迁移和侵袭能力显著增加,不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理后,结果显示TGFβ1可以显著提高BEL-7402细胞的迁移和侵袭能力,TGFβ1的抑制剂可以取消上述效应;④与LX2细胞共培养后,在mRNA水平,肝癌细胞SMMC-7721上皮标志物E-Cadherin的表达显著降低,间质标志物N-Cadherin、Vimentin的表达显著升高,调控EMT过程的转录因子Twist的表达显著升高,BEL-7402及HepG2间质标志物fibronectin表达升高。不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理肝癌细胞SMMC-7721后,TGFβ1可以抑制E-Cadherin的表达,显著促进Vimentin的表达,抑制剂可以取消TGFβ1的作用;在蛋白水平,肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)与 LX2 细胞共培养后,E-Cadherin 的表达降低,Vimentin的表达显著升高。不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理单独培养以及与LX2共培养的肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,TGFβ1 可以抑制 E-Cadherin的表达,显著促进Vimentin的表达,抑制剂可以取消TGFβ1的作用。⑤与LX2细胞分别共培养后,在mRNA水平,三株肝癌细胞侵袭转移相关分子发生变化;SMMC-7721 细胞中 EGF、VEGF、MMP1、MMP2、MMP9、MMP13的表达显著升高,BEL-7402细胞MMP1、MMP2、MMP9表达显著升高,HepG2细胞VEGF、MMP1表达显著增高;在蛋白水平,SMMC-7721细胞中MMP2的表达显著升高,BEL-7402、HepG2细胞中MMP2、VEGF表达显著增高。不同浓度TGFβ1及其抑制剂处理单独培养以及与LX2共培养的肝癌细胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)后,在 mRNA 水平,TGFβ1 可以显著上调SMMC-7721细胞MMP2、VEGF的表达,且共培养体系中升高的更为明显,TGFβ1的作用可以被其抑制剂取消;在蛋白水平,TGFβ1可以显著促进三株肝癌细胞MMP2、VEGF的表达,抑制剂可以取消TGFβ1的上述作用。结论:①在肝癌微环境中,TGFβ1能够促进HSCs向CAFs转化。②HSCs向CAFs转化可促进肝癌细胞的EMT过程,从而促进肝癌细胞的侵袭转移。③实验结果为研究间质细胞在肝癌侵袭转移中的作用提供实验依据。