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目的:肥胖是由于体内能量摄入和消耗不平衡而导致的脂肪的病理性积累,从而导致组织功能紊乱。脂肪细胞分化和脂质积累与肥胖的发生发展密切相关。肥胖可引起胰岛素抵抗、2型糖尿病、心脏病、终末期肾病甚至一些肿瘤性疾病,严重影响这类人群的生活质量。脂肪组织的过度堆积是上述疾病的主要原因。因此,深入研究影响脂肪组织过度积累的调控因素成为改善肥胖的关键。烟酰胺N-甲基转移酶（Nicotinamide N-methyltransferase,NNMT）是一种甲基化酶,在体内能够使烟酰胺甲基化,生成N1-甲基烟酰胺并最终从体内排出。人体脂肪组织NNMT表达与肥胖、胰岛素抵抗呈正相关。在体敲低NNMT表达,可以减少小鼠高脂饮食诱导的脂肪积累,改善糖耐量。但NNMT对脂肪细胞分化过程中代谢功能的影响及其具体机制尚不明确。自噬是细胞用于清除和降解细胞内容物的主要过程。脂自噬与传统脂肪酶介导的脂解作用一同在脂质代谢中发挥重要作用,不仅影响脂肪细胞的脂质代谢,而且还与多种代谢性疾病密切相关。肥胖患者和肥胖小鼠的脂肪组织中自噬水平明显升高,并且抑制自噬可以减轻肥胖。小鼠模型中促进自噬会加速KLF2和KLF3（脂肪细胞分化的负调节剂）的降解,从而上调PPAR-γ和C/EBPβ的表达（脂肪分化的正效应调节剂）,有利于脂肪的形成。本研究目的是检测NNMT及利用过表达及敲低的方法干扰NNMT表达对3T3-L1脂肪细胞分化过程中脂质积累、甘油三酯含量、脂肪分化相关转录因子（PPARγ、C/EBPα、SREBP1）、脂质代谢相关基因（FABP4、FAS、FATP1（Slc27a1）、LPL）、脂肪因子表达（ADIPOQ、LEP）及细胞自噬相关基因（Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14）的转录和LC3I及LC3 II、Beclin1及P62蛋白表达情况,探讨NNMT影响脂肪积累的可能机制。研究方法:1、观察NNMT在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的表达变化情况,利用IBMX、地塞米松及胰岛素对3T3-L1细胞进行程序性诱导分化,利用q PCR检测细胞分化过程中Nnmt m RNA表达水平,通过免疫印迹检测NNMT蛋白表达情况。2、pc DNA3.1-Nnmt-3x Flag-C表达载体的转染效率鉴定。3、将质粒pc DNA3.1-NNMT-3x Flag-C及对照质粒分别转染入3T3-L1细胞中,并对细胞进行诱导分化,之后利用油红O染色检测脂质积累情况,同时检测细胞甘油三酯的变化情况,观察过表达NNMT对3T3-L1细胞的脂质积累的变化。4、q RT-PCR方法检测过表达NNMT使3T3-L1细胞的脂肪分化相关转录因子（PPARγ、C/EBPα、SREBP1）、脂质代谢相关基因（FABP4、FAS、FATP1（Slc27a1）、LPL）、脂肪因子（ADIPOQ、LEP）的转录水平的变化,免疫印迹方法检测PPARγ、ADIPOQ蛋白表达水平的变化。5、NNMT慢病毒干扰载体感染3T3-L1细胞复感染指数（MOI）值的确定。6、NNMT慢病毒干扰载体转染3T3-L1细胞敲低NNMT表达效率的鉴定。7、利用油红O方法检测脂肪细胞的脂质积累,比色法检测甘油三酯含量,观察敲低NNMT表达对3T3-L1细胞的脂质积累的变化。8、q RT-PCR方法检测敲低NNMT对3T3-L1细胞的脂肪分化相关转录因子（PPARγ、C/EBPα、SREBP1）、脂质代谢相关基因（FABP4、FAS、FATP1（Slc27a1）、LPL）、脂肪因子（ADIPOQ、LEP）的转录水平的变化,免疫印迹方法检测PPARγ、ADIPOQ蛋白表达水平的变化。9、利用q PCR检测3T3-L1细胞在分化第0天、2天、4天、6天自噬相关基因Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14的转录水平变化。10、用NNMT过表达质粒转染3T3-L1细胞,之后进行诱导分化,检测第6天的细胞自噬水平改变。利用q PCR检测Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14的m RNA水平变化,免疫印迹检测LC3 I及LC3 II、Beclin1及P62的蛋白表达水平。11、用慢病毒干扰载体LV-NNMT-RNAi3转染3T3-L1细胞,之后进行诱导分化,检测第6天的细胞自噬水平改变。利用q PCR检测Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14的m RNA水平变化,免疫印迹检测LC3 I及LC3 II、Beclin1及P62的蛋白表达水平。结果:1、在3T3-L1细胞诱导分化过程（第0天、2天、4天、6天）中,Nnmt m RNA表达逐渐增加（P<0.0001）,蛋白水平也逐渐增加（P<0.05及P<0.001）,其中第4天、第6天表达增加水平更加明显（P<0.0001）。2、与对照质粒转染组相比pc DNA3.1-NNMT-3x Flag-C组m RNA水平显著升高（P<0.0001）,蛋白表达也明显升高（P<0.01）。3、与对照组相比,转染pc DNA3.1-NNMT-3x Flag-C组3T3-L1细胞诱导分化第6天脂质积累更加明显（P<0.0001）,甘油三酯含量更高（P<0.0001）。4、与对照质粒转染组相比,pc DNA3.1-NNMT-3x Flag-C组的Pparg、Srebf1、Cebpa、Fabp4、Fasn、Slc27a1、Lpl的m RNA水平显著升高,Adipoq和Lep的m RNA水平显著下降（P<0.0001）;PPARγ蛋白表达明显升高,ADIPOQ蛋白表达明显下降（P<0.0001）。5、慢病毒载体LV-NNMT-RNAi转染3T3-L1细胞,在MOI值为100时,转染效率达80%以上且细胞生长良好。6、与对照组相比LV-NNMT-RNAi3组的Nnmt m RNA水平下降最明显（P<0.0001）,NNMT的蛋白表达下降也最明显（P<0.001）,表明构建的LV-NNMT-RNAi3慢病毒干扰载体可以在3T3-L1细胞中有效的干扰目的蛋白NNMT表达,因此选择慢病毒干扰载体LV-NNMT-RNAi3进行后续实验。7、与对照组相比,LV-NNMT-RNAi3组3T3-L1细胞诱导分化第6天脂质积累明显减少（P<0.0001）,甘油三酯含量下降明显（P<0.05）。8、与对照组相比LV-NNMT-RNAi3组的Pparg、Srebf1、Cebpa、Fabp4、Fasn、Slc27a1、Lpl转录水平明显下降,Adipoq和Lep的m RNA水平明显增高（P<0.0001）,PPARγ蛋白表达明显下降,ADIPOQ的蛋白表达明显上升（P<0.0001）。9、在3T3-L1细胞诱导分化过程中,自噬相关基因Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14的m RNA逐渐增加,其中第6天m RNA增加最明显。10、与对照组相比NNMT过表达组的Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14 m RNA水平显著升高（P<0.0001及P<0.05）,LC3 II/I及Beclin1的蛋白表达水平明显升高、P62蛋白水平明显下降（P<0.0001）。11、与对照组相比,NNMT敲低组的Beclin1、ATG7、ATG12、ATG14的m RNA水平显著降低（P<0.0001及P<0.05）,LC3 II/I及Beclin1的蛋白表达水平明显下降,P62蛋白水平明显上升（P<0.0001）。结论:过表达NNMT通过增加脂肪分化相关转录因子,促进3T3-L1细胞的脂肪积累,并通过增加脂肪代谢相关基因,减少脂肪因子,增强分化后脂肪细胞的功能。减少NNMT表达通过减少脂肪分化相关转录因子,抑制3T3-L1细胞的脂肪积累,并通过减少脂肪代谢相关基因,增加脂肪因子,抑制分化后脂肪细胞的功能。脂肪细胞的分化过程中有自噬的参与,NNMT能够影响脂肪细胞的自噬。