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迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）为唇形科迷迭香属植物。迷迭香作为高价值药食同源植物,其重要的活性成分包括黄酮类、萜类、酚类等。本研究以迷迭香叶片诱导筛选愈伤组织建立迷迭香细胞悬浮培养体系产次生代谢产物,诱导子MeJA对迷迭香悬浮细胞次生代谢产物的调控作用。为进一步挖掘调控迷迭香重要次生代谢产物积累有益基因资源,以迷迭香悬浮细胞为材料,以不同浓度MeJA处理下迷迭香悬浮细生理生化测定分析为基础,进行迷迭香悬浮细胞MeJA响应的m RNAs、miRNAs组学分析,并进行部分m RNAs、miRNAs及其靶基因的q PCR验证。基于迷迭香悬浮细胞摇瓶培养体系及转录组的研究基础,探索5 L搅拌式生物反应器中MeJA及其分批次添加蔗糖对迷迭香悬浮细胞放大培养及重要次生代谢产物积累的影响。本研究诣在探讨MeJA对迷迭香重要次生代谢产物积累的调控机制,为挖掘利用迷迭香悬浮细胞MeJA响应基因资源提供科学依据。主要研究结果如下:1.建立迷迭香的愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系以迷迭香叶片和茎段为初始材料,成功诱导迷迭香愈伤组织,初代愈伤组织呈黄白色致密不松散状态,采用2,4-D、NAA、KT、6-BA不同激素组合、黑暗与12 h/d光照条件进行继代增殖培养筛选出质地松软的高产愈伤组织,最终试验结果表明:MS+1.0 mg/L 2,4-D、蔗糖30 g/L是愈伤组织培养的最适培养基,培养周期结束时鲜重7.03 g/瓶,并将获得质地疏松颗粒小、外观鲜亮的淡黄色愈伤组织进行迷迭香悬浮细胞悬浮培养。迷迭香细胞悬浮培养试验结果表明:细胞生长呈现典型的“S”曲线,暗培养周期8-9 d,最适培养基MS+1.0 mg/L 2,4-D、蔗糖30 g/L,最适接种量40 g/L,温度25℃,转速120 rpm,迷迭香细胞鲜重35.72 g/100 ml,干重0.76 g/100 ml,迷迭香酸含量3.15 mg/g·DW,综上所述,建立了适宜的迷迭香细胞悬浮培养体系。2.不同浓度MeJA对迷迭香悬浮细胞次生代谢产物积累及生理生化指标的影响以迷迭香悬浮细胞为研究对象,在培养过程的第6 d进行0、10、50、100、150、200μmol/L浓度MeJA处理。结果表明:与不添加MeJA相比较,10-200μmol/L的MeJA处理后继续培养2 d,对迷迭香悬浮细胞中类黄酮、迷迭香酸、鼠尾草酸的积累均有不同程度的促进作用,当浓度为100μmol/L MeJA时悬浮细胞中迷迭香酸含量到达最高值为3.29 mg/g,是对照组的1.66倍,200μmol/L MeJA时鼠尾草酸和类黄酮含量到达最高值分别为为2.71 mg/g和21.38 mg/g,分别是是对照组的1.84和1.44倍;悬浮细胞生长量无显著变化,但细胞活力随浓度增加而降低,浓度为200μmol/L MeJA时细胞活力最低。在悬浮培养过程中的第0、2（延迟期中期）、4（对数期初期）、6 d（对数期中后期）添加MeJA,处理浓度为100μmol/L时,试验结果表明:在第4、6 d添加MeJA悬浮细胞中迷迭香酸、鼠尾草酸、类黄酮含量显著高于第0、2 d;第0、2 d添加MeJA后悬浮细胞生长量显著降低,同时悬浮细胞细胞活力均随添加时间的延后升高并且都低于对照组。说明培养过程的对数生长期外源添加MeJA对迷迭香悬浮细胞迷迭香酸、鼠尾草酸、类黄酮的积累有显著的促进作用,但对细胞生长量无显著作用。不同浓度MeJA处理迷迭香悬浮细胞时,PAL、SOD、POD、CAT和PPO酶活力在0-100μmol/L的MeJA处理下随浓度升高显著升高,试验结果表明外源添加10-200μmol/L MeJA激活了迷迭香悬浮细胞酶类抗氧化系统应对外界刺激,调控代谢反应;内源激素GA、IAA和JA含量在0-150μmol/L的MeJA处理下随浓度升高显著升高,200μmol/L浓度下开始下降,ABA和SA含量则在0-200μmol/L的MeJA处理下随浓度升高显著降低,结果说明,MeJA处理迷迭香悬浮细胞后,对不同内源激素之间存在协调或拮抗作用。3.不同浓度MeJA对迷迭香悬浮细胞次生代谢产物积累的转录组学分析对不同处理迷迭香悬浮细胞（CK、M10、M50、M100）进行m RNAs测序,测序结果分析验证。在CKvs M10、CKvs M50和CKvs M100比较组中,分别鉴定出7836、6797和8310个差异表达基因,其中上调基因分别为3596、3025和4528个,下调基因分别为4240、3772和3782个;转录组差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果表明细胞壁生物发生、天冬酰胺生物合成、苯丙烷生物合成、半乳糖代谢、类黄酮生物合成、亚油酸代谢等一些基础代谢途径在迷迭香悬浮细胞MeJA响应过程中高度富集;Mapman的初级代谢分析结果多数差异基因主要分布于细胞、脂类、蔗糖、氨基酸、抗坏血酸和谷胱甘肽等途径;Mapman的次生代谢分析发现差异基因主要集中在苯丙烷生物合成、非甲羟戊酸途径、莽草酸途径、甲羟戊酸途径、类黄酮、类胡萝卜素、生物碱类等途径。通过对JA生物合成和信号转导途径,苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成、萜类物质生物合成、植物激素信号转导等途径的差异表达基因的表达量热图分析,发现多数差异表达基因受MeJA的诱导上调表达,并且不同浓度MeJA对基因诱导效果不同,如100μmol/L MeJA比50、10μmol/L更能诱导JA生物合成和信号转导途径基因LOX、AOS、JAZ和MYC2的表达,差异表达的转录因子分析发现,MYB、AP2-EREBP、b HLH等均为迷迭香悬浮细胞响应MeJA影响显著的转录因子,结果表明MeJA处理后能够显著影响苯丙烷生物合成,类黄酮及萜类物质合成等代谢途径结构基因,上述途径的关键结构基因是MeJA处理后迷迭香悬浮细胞代谢产物显著积累的候选基因。q PCR验证表明转录组数据的基因表达谱数据是可信的。4.不同浓度MeJA对迷迭香悬浮细胞次生代谢产物积累的miRNAs分析对不同处理（CK、M10、M50、M100）的迷迭香悬浮细胞进行miRNAs测序,测序结果验证分析表明,共获得22个miRNA家族的69个已知的miRNAs,获得181个Novel miRNAs;在CKvs M10、CKvs M50和CKvs M100比较组中,共筛选出差异表达miRNA 86个,其中包括32个已知miRNAs和54个Novel miRNAs;在CKvs M10、CKvs M50和CKvs M100比较组特异差异表达的已知miRNAs分别为4、7和4个,Novel miRNAs分别为6、23和6个。miRNA靶基因进行KEGG富集分析结果表明,MeJA对迷迭香悬浮细胞次生代谢产物存在多种响应途径,包括植物激素信号转导、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、黄酮与黄酮醇生物合成、花青素生物合成等;miRNAs靶基因的Cytoscape分析结果表明miR156a-5p、miR160、miR160a-5p、miR167d1、miR396a-3p4、miR396a-3p5、miR396b、miR6300、novelmir72、novelmir151、novelmir176和novelmir179最有可能参与MeJA对迷迭香悬浮细胞代谢产物积累的影响。通过对差异表达miRNAs的靶基因的Mapman以及表达量的热图分析表明不同浓度MeJA对细胞壁、氨基酸、淀粉和蔗糖、三羧酸循环、类黄酮代谢以及蛋白质水解酶类和信号转导调控作用显著,其中涉及植物激素信号转导的miRNAs及其靶基因:miR160a-5p及其靶基因ARF,miR171b-3p、miR171b-3p3和miR171d1及其靶基因DELLA,miR171b-3p及其靶基因ETR,miR156a、miR156a-5p和novelmir4及其靶基因BRI1,各激素信号途径相互作用进而调控迷迭香悬浮细胞代谢产物积累;苯丙烷生物合成途径基因peroxidase被miR167d1靶定,花青素生物合成途径的3AT、黄酮与黄酮醇生物合成和异黄酮生物合成途径的IF7MAT被novelmir176、novelmir11和novelmir179靶定,进而影响花青素、类黄酮代谢合成。q PCR验证结果表明迷迭香悬浮细胞miRNAs与靶基因之间存在复杂的正负调控关系。在不同浓度MeJA响应过程中,一些miRNAs能够特定MeJA浓度下负调控其靶基因。5.基于5L生物反应器中迷迭香悬浮细胞放大培养本研究将前文迷迭香细胞悬浮培养结论应用于5 L搅拌式生物反应器（Biostat?B,Sartorius Stedim Biotech）进行放大培养,基于摇瓶中的迷迭香细胞悬浮培养体系,建立生物反应器中迷迭香细胞悬浮培养体系。试验结果表明:迷迭香细胞5 L搅拌式生物反应器悬浮培养的最佳条件是在100 rpm的搅拌速度,100 ccm的通气量,40 g/L的接种量,培养周期14 d。基于已建立的迷迭香悬浮细胞放大培养体系,研究100μmol/L MeJA对悬浮细胞生长量、迷迭香酸和类黄酮含量、细胞活力、培养液底物消耗量、培养体系的p H及溶氧和关键基因PAL、CHS、MYC2表达量的变化情况。结果发现:培养14 d结束后,添加MeJA处理后,悬浮细胞生长量无显著变化,类黄酮代谢途径关键基因PAL和CHS以及JA信号转导途径MYC2均显著上调表达,类黄酮含量增加4.62 mg/g,迷迭香酸含量增加0.49 mg/g。基于已建立并优化的迷迭香悬浮细胞放大培养体系,研究分批次添加碳源即将培养基初始蔗糖为20 g/L后续在培养过程的第6 d补加蔗糖,对悬浮细胞生长量、类黄酮和迷迭香酸含量、细胞活力、培养液底物消耗量培养体系的p H及溶氧的变化情况。试验结果发现:培养周期结束后,迷迭香悬浮细胞干重降低0.3g/L,类黄酮含量增加0.89 mg/g,迷迭香酸含量增加0.19 mg/g,说明分批次添加糖源可以提高迷迭香悬浮细胞类黄酮和迷迭香酸的积累,有效降低悬浮细胞褐化现象。