论文部分内容阅读
目的探讨自噬对莱菔硫烷抗食管鳞癌活性的影响及分子机制。方法一、SFN对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成以及凋亡的影响及分子机制1.CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测食管鳞癌细胞中SFN对细胞增殖、克隆形成以及细胞凋亡的影响。2.Western blot法检测SFN对食管鳞癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白BAX和Caspase 9蛋白表达的影响。二、SFN对食管鳞癌细胞中自噬的影响及分子机制1.Western blot法、免疫荧光法检测SFN单用及联用CQ后对食管鳞癌细胞中LC3-Ⅱ、p62表达的影响;然后用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染实验检测SFN对自噬流的影响。2.用SFN处理食管鳞癌细胞后,Western blot法检测自噬相关蛋白Atg5和Atg7表达的影响;分别提取胞浆蛋白和核蛋白,然后用Western blot法检测SFN对胞浆和核蛋白中Nrf2的表达的影响。用Nrf2抑制剂ML385单用或联用SFN处理细胞,Western blot法检测Nrf2及自噬相关蛋白LC3和p62的表达。3.CCK-8法和克隆形成实验检测ML385对食管鳞癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。在CQ抑制自噬和血清饥饿诱导自噬改变自噬活性的条件下,CCK-8法检测SFN对食管鳞癌细胞增殖的影响。三、抑制自噬对SFN抗食管鳞癌作用的影响及分子机制1.CCK-8法、克隆形成实验及流式细胞术测定SFN单用及联用自噬抑制剂CQ对食管鳞癌细胞增殖、克隆形成能力及凋亡的影响。并用CCK-8法及克隆形成实验检测用Beclin-1 shRNA下调自噬关键蛋白Beclin-1后SFN对食管鳞癌细胞增殖和克隆形成能力的影响。2.Western blot法检测CQ联用SFN后对凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX和Cleaved-caspase 9表达的影响。Western blot法和免疫荧光法检测SFN单用及联用CQ对Nrf2蛋白表达和细胞分布的影响。四、SFN联用CQ对裸鼠移植瘤生长的影响及分子机制1.通过建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型,检测SFN单用及联用CQ后对肿瘤生长的影响,通过测得肿瘤体积以及重量计算相对肿瘤增殖率和肿瘤抑制率。2.用H&E染色法和TUNEL法检测裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡情况,并用Western blot法检测组织蛋白中自噬相关蛋白、Nrf2、HO-1及凋亡相关蛋白的表达。3.通过检测体重变化、血常规参数、肝肾毒性指标、脏器系数以及肝肾H&E染色对药物安全性进行初步评价。结果一、SFN通过激活caspase通路抑制食管鳞癌细胞活性1.SFN抑制食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,并诱导细胞发生凋亡。2.SFN促进食管鳞癌细胞中Cleaved-caspase9蛋白的表达,但对Bcl-2和BAX的表达无明显影响。二、SFN通过激活Nrf2的表达诱导食管鳞癌细胞自噬的发生1.SFN在食管鳞癌细胞中能够升高LC3-Ⅱ的表达和胞内聚集,并且降低p62的表达;SFN联用自噬抑制剂CQ后LC3-Ⅱ蛋白表达进一步升高,而p62的降解被抑制;另外,双标腺病毒实验证实SFN可以明显增加细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量。上述结果说明SFN能够通过促进自噬流诱导食管鳞癌细胞发生自噬。2.SFN对自噬相关基因Atg5和Atg7的表达无明显影响,说明SFN不影响自噬的起始阶段。SFN单用时能够升高Nrf2核内表达水平,激活Nrf2活性;当SFN联用Nrf2抑制剂ML385后,引起LC3表达降低,p62升高,说明SFN通过激活Nrf2诱导自噬活性。3.ML385能够抑制食管鳞癌细胞中Nrf2活性,且能够抑制食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,说明SFN激活Nrf2可能是其抗肿瘤活性的不利因素,另外,CQ能够增强SFN对细胞增殖的抑制作用,而用血清饥饿诱导自噬后削弱了SFN的细胞增殖抑制作用,这些结果提示着SFN激活Nrf2可能引发细胞保护性自噬。三、抑制自噬增强SFN抗食管鳞癌活性1.CQ能明显增强SFN对食管鳞癌细胞增殖及克隆形成的抑制作用及对细胞凋亡的诱导作用,说明CQ可以明显增强食管鳞癌细胞对SFN的敏感性。另外,下调Beclin-1也能增强SFN对食管鳞癌细胞增殖和克隆形成的抑制作用。以上结果表明抑制自噬能够增强SFN对食管鳞癌的抗肿瘤效果。2.SFN单用引起Cleaved-caspase 9表达的升高,但对Bcl-2和BAX的表达却没影响,但是当联用CQ后,能够降低Bcl-2的表达水平并且使Cleaved-caspase 9表达水平进一步升高。当SFN联用自噬抑制剂CQ后,Nrf2表达被抑制,说明CQ能够抵消SFN对Nrf2的激活作用并增强SFN对caspase通路的激活作用。四、CQ增强SFN对裸鼠移植瘤生长的抑制作用1.SFN单用及联用能够抑制裸鼠移植瘤的生长,诱导体内发生细胞凋亡,但联用CQ后,其抑制肿瘤生长和诱导凋亡的作用更加明显。2.和体外实验结果一致,SFN和CQ联用能够抑制Bcl-2蛋白表达,并进一步促进Cleaved-caspase 9的表达;另外,二者联用后抑制Nrf2和HO-1蛋白的表达。3.和空白组相比,体重变化、脏器系数、血常规参数以及肝肾血生化指标和H&E染色结果均无明显变化,说明治疗剂量下SFN和CQ对裸鼠均无明显不良反应。结论自噬抑制剂CQ能够增强SFN的抗食管鳞癌作用,其机制与CQ促进SFN对caspase通路激活和抵消SFN对Nrf2的激活作用有关。