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吲哚3-草酰胺衍生物D-24851是德国ASTA公司开发的一种新型、具有抗肿瘤活性的小分子化合物,它能够抑制微管聚合并将细胞周期阻滞在G2/M期。体外实验发现其对多种恶性肿瘤细胞都有活性,体内试验中,治疗剂量无神经和血液毒性,口服有效,现已进入临床I期实验。可望成为临床上潜力巨大抗肿瘤药物。本实验室从天然产物中引入活性基团,合成了一系列结构新颖且抗肿瘤活性较好的吲哚3-草酰胺衍生物,其中YB-L12为从天然产物胡椒胺中引入活性胡椒苄基,合成的吲哚3-草酰胺衍生物,在体外有较强的抗肿瘤活性,且具有良好的量效关系。本文进一步研究了YB-L12对体外培养的多种肿瘤细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用及特点,并初步探讨了它的作用机制。1 YB-L12的体外抗肿瘤作用本文通过MTT、SRB实验法发现YB-L12对多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用,IC50为0.10～9.41μM。但单从MTT结果来看,YB-L12对癌细胞和正常细胞选择性不强,对人血管内皮细胞(VEC)及人疤痕成纤维细胞(fb)的IC50分别为1.20μM和2.40μM。从SRB结果可看出:YB-L12对人红白血病细胞(K562)及阿霉素诱导的多药耐药株(K562/AO2)均有抑制作用,GI50分别为:1.70μM和0.94μM。通过对Hela、SKOV3细胞生长曲线的观察,发现不同浓度的YB-L12对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用,并且具有显著的量效关系。2 YB-L12的体内抗肿瘤作用体内移植肿瘤实验亦观察到YB-L12对小鼠实体型肉瘤S180有一定的治疗作用。连续灌胃给予YB-L12 (75mg/kg/d及150mg/kg/d) 6天,对小鼠肉瘤S180的生长抑制率分别为34.89%和47.60%,高剂量组和低剂量组瘤重均比空白对照组小(P<0.01),而低剂量组与高剂量组瘤重相比无差异(P>0.05),但给药组小鼠的体重较空白对照组无明显的下降(P>0.05),说明YB-L12在体内实验表现出良好的肿瘤抑制作用,且治疗剂量下无明显系统毒性。3 YB-L12对肿瘤细胞周期的影响本文采用流式细胞仪分析了YB-L12对Hela细胞周期移行的影响。用不同浓度的YB-L12(0.2～0.8μM)分别作用于细胞12和24小时。YB-L12可使细胞周期阻断在G2/M期。4 YB-L12诱导肿瘤细胞的凋亡YB-L12能够诱导Hela细胞凋亡。不同浓度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela和SKOV3细胞24小时后,分别用Giemsa染液和荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色,前者将细胞核染成蓝紫色,胞浆染成粉红色。未加药组的细胞核染色均一、结构完整,可见分叶核;给药组细胞呈现核膜皱缩,核碎裂。后者在紫外光激发下发蓝色荧光,通过荧光显微镜观察发现YB-L12可使细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,并且随着YB-L12浓度的加大,镜下这种细胞形态的变化愈加明显,凋亡细胞的比例逐渐增加。在DNA凝胶电泳实验中,用不同浓度的YB-L12(0.1～0.8μM)分别作用于Hela和SKOV-3细胞24小时,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯子(DNA ladder)”图谱。用流式细胞仪进行细胞的DNA含量测定,可见经不同浓度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela细胞24小时后,出现一个“亚G1峰”,且凋亡细胞的比例随着YB-L12浓度的升高而增加,呈一定的剂量依赖性。从以上四方面的结果可以认为YB-L12能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。5 YB-L12对凋亡相关基因p53、caspase-3、bcl-2及bax mRNA水平的影响本文观察了YB-L12对凋亡相关基因p53、caspase-3、bcl-2及bax mRNA水平的影响。RT-PCR结果显示0.2 ~0.8μM YB-L12能升高p53、caspase-3、bax mRNA的水平,同时降低bcl-2 mRNA的水平,与对照组相比差异均有统计学意义。提示YB-L12诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调了p53、caspase-3及bax mRNA的水平,同时下调凋亡抑制基因bcl-2 mRNA的水平,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。6 YB-L12对微管的影响微管是由微管蛋白和微管相关蛋白构成的蛋白质多聚体。微管也是癌症化疗的靶点之一,不同浓度的YB-L12(0.2～0.8μM)作用于Hela细胞12小时后,通过微管免疫荧光法观察YB-L12对微管形态的影响,可见对照组的Hela细胞,微管形态结构完整,有时单根微管的轮廓亦可清晰辨认;而用0.2μM YB-L12处理后微管结构受到一定程度的破坏,数量减少、断片增多;高剂量0.8μM的YB-L12则使绝大部分微管结构破坏,微管不再成束,仅在核周残留少量点状不规则荧光。阳性对照药D-24851(0.1μM)处理后的细胞微管不再成束,断裂成片断,呈点状不规则荧光,这与YB-L12处理后的细胞微管形态变化相似。而紫杉醇(0.01μM)处理后的细胞微管呈三个或多个区域聚集分布,这个结果与紫杉醇抑制微管解聚的作用相一致。由此证明:YB-L12可以通过抑制微管蛋白聚合,影响肿瘤细胞纺锤体形成,来抑制细胞有丝分裂,其对微管的作用与D-24851相似。综上所述,YB-L12结构新颖,低毒性,且在体内外能明显抑制肿瘤细胞的生长,在体外对多药耐药肿瘤细胞也有抑制作用;能将肿瘤细胞生长周期阻断在G2/M期,同时通过影响癌基因p53、caspase-3、bax及抑癌基因bcl-2 mRNA水平,抑制细胞微管聚合,影响纺锤体形成来阻止细胞有丝分裂,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。因此,YB-L12有望成为一个有自主知识产权,低毒性的新型抗肿瘤化合物。