背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大神经退行性疾病,在60岁以上老人中,其发病率达到了1%[1],该病不仅严重影响了病人的身心健康,而且给家庭及社会都会造成巨大的负担。PD表现为慢性进展病程,临床表现多样,其中静止性震颤是PD的典型表现。PD的病理表现主要是中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺能神经元缺失,从而引起纹状体内多巴胺含量显著减少,最终导致发病[2]。小胶质细胞是中枢神经系统内的免疫固有细胞,其在监视大脑内损伤及病原体侵入方面发挥重要的免疫学作用,同时在维护神经元微环境稳定中发挥重要的调节作用。小胶质细胞在中脑SNc区密度明显高于其他脑区,细胞动物实验以及PD病人尸检脑片均已证明了小胶质细胞在PD发病过程中起了重要作用,因此小胶质细胞介导的神经系统炎症反应被认为是多巴胺能神经元的丢失、PD发病的重要原因之一。肌细胞增强因子(Myocyte enhancer factor,MEF2)作为机体内重要的转录因子,其广泛表达于各种细胞,如骨骼肌细胞、心肌细胞,免疫细胞及神经元等,通过调节多种基因的转录而发挥重要的作用。近年来,不断的研究表明,MEF2在PD病人中,对于多巴胺能神经元的保护具有重要作用。此外,已有研究显示在外周T细胞中可以检测到MEF2D表达,并且MEF2D参与炎症反应的调节过程。但是,对于MEF2D在小胶质细胞中是否表达,以及其在小胶质细胞中的主要作用的研究,目前国内外还没有这方面的报道。目的本实验主要研究转录因子MEF2D在脑内的小胶质细胞内的表达情况、MEF2D转录调控的下游靶基因,以及在小胶质细胞活化时,MEF2D在炎症反应中的调节作用与相关机制及其对多巴胺能神经元存活的影响。方法首先,观察活化的小胶质细胞内MEF2D的表达水平。通过腹腔注射MPTP,建立C57小鼠急性PD模型,制作SNc区脑组织切片,使用免疫荧光染色观察小胶质细胞内的MEF2D水平。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2细胞系及原代培养的胶质细胞,通过q PCR及免疫印迹检测技术,观察不同时间点下MEF2D的m RNA水平及蛋白水平表达情况,然后利用EMSA方法检测MEF2D的活性变化。其次,探索LPS刺激条件下BV2细胞系内MEF2D的功能作用。通过q PCR及ELISA实验方法检测LPS刺激条件下BV2内的炎症因子TNF-α的表达水平及抗炎因子IL-10的表达水平。通过Ch IP技术检测MEF2D与IL-10基因启动子区结合的情况。利用含有能特异性干扰MEF2D的sh RNA的重组慢病毒感染BV2,检测LPS刺激BV2细胞条件下,细胞内IL-10及TNF-α的表达情况。利用BV2细胞的培养上清建立小胶质细胞与神经元的共培养模型,通过MTT及TUNEL实验检测不同实验条件下,共培养中的神经元存活情况。结果实验一:中脑黑质区活化的小胶质细胞内MEF2D的表达变化。通过建立急性PD模型,可以看到受到刺激后活化的小胶质细胞内MEF2D表达水平明显升高,同时SNc区多巴胺能神经元死亡增加。使用LPS刺激BV2细胞及原代培养的胶质细胞,可以看到,在受到LPS刺激24小时后,原代细胞内的MEF2D表达水平明显升高,而在BV2细胞内,LPS刺激18小时后MEF2D的m RNA水平及蛋白水平均开始升高。使用EMSA技术可以检测到LPS刺激24小时后,BV2内的MEF2D蛋白活性水平也是升高的。实验二:活化的小胶质细胞内MEF2D调控的靶基因的研究。检测LPS刺激条件下,BV2的TNF-α及IL-10的表达,可以看到TNF-α表达水平在2小时达到最高,而IL-10的表达从刺激后18小时开始升高,且其升高趋势和MEF2D的变化是相符合的。Ch IP实验显示,IL-10是MEF2D调节的下游因子。使用慢病毒干扰BV2内MEF2D的表达,免疫印迹实验检测干扰效率符合实验要求。干扰MEF2D后,LPS刺激后BV2内IL-10的表达水平及分泌水平均显著降低,而TNF-α的m RNA表达水平明显升高。实验三:活化的小胶质细胞内MEF2D对于多巴胺能神经元存活的影响用培养BV2细胞的上清液培养多巴胺能神经元细胞系SN4741细胞,建立共培养模型。干扰BV2细胞内MEF2D的表达或者利用IL-10中和抗体阻断IL-10的功能,均能够提高LPS刺激后BV2细胞培养上清液的神经元毒性,诱导更多的神经元凋亡。结论我们的研究首次揭示了MEF2D在小胶质细胞内表达,其表达水平在小胶质细胞活化后明显升高,升高的MEF2D同时伴随着神经炎症因子的表达降低及抗炎因子的表达升高,通过分子生物学及细胞生物学方法我们发现MEF2D直接调控了抗炎因子IL-10的表达。从而阐明了一个全新的小胶质细胞活化后炎症的发生发展的调节过程:小胶质细胞活化引起了MEF2D水平的升高,MEF2D调节IL-10基因的转录过程,从而使其表达及分泌增多,升高的抑炎因子抑制了小胶质细胞分泌炎性因子,明确了MEF2D可决定小胶质细胞M1和M2表型转化、改变微环境、调节神经元应激反应,为PD的治疗提供了新的研究靶点。