为了探讨将纤连蛋白结合蛋白A(FnBP-A)用于金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的基因治疗和作为抗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的药物和诊断试剂进行开发,在克隆出纤连蛋白结合蛋白A基因(fnbA)的基础上,构建了真核表达载体pEBF和原核表达载体pET-fnbA1并对fnbA基因进行了原核表达和表达产物功能进行了研究,为进一步纯化和研究其在免疫治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎中的作用、研究新型DNA疫苗及生产转基因动物奠定了基础,同时也为临床上奶牛乳房炎的防治提供新方法和新手段。研究结果如下:1.根据GenBank(登陆号:J04151)中公布的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因(fnbA)序列设计特异性引物,以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得3.6 kb的DNA片段,其中包含完整的编码序列。序列分析表明,片段与GenBank中登录的金黄葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A序列的同源性为99.1%。在读码框内,只有六个碱基发生点突变。分析表明,这六处突变不影响蛋白质功能。2.利用定向克隆的方法,将纯化的基因fnbA先克隆至pBCP中,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建了fnbA的乳腺特异性表达载体pEBF。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因,并且报告基因和目的基因表达为非融合型表达。3.利用定向克隆的方法,将fnbA克隆至pGEM-T easy Vector中,成功构建出了克隆质粒pGEM-fnbA1中。将纯化的基因fnbA1亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒pET-fnbA1。4.将原核表达质粒pET-fnbA1,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后SDS-PAGE分析,在约165 ku处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带。5. Western blot分析重组蛋白,在目的蛋白相应位置出现了特异性的染色条带,这表明所表达的重组蛋白能够与金黄色葡萄球菌FnBP-A蛋白发生特异性结合,表明该蛋白是金黄色葡萄球菌FnBP-A。