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研究背景:肿瘤浸润与转移是肿瘤细胞与机体相互作用的极其复杂的多环节过程,其中肿瘤细胞产生和释放多种水解酶降解细胞外基质（ECM）或基底膜（BM）可能是浸润与转移的主要内容。BM的主要成分之一Ⅳ型胶原分子由于其独特的结构,大部分蛋白酶对其无降解作用,而Ⅳ型胶原酶可特异性降解Ⅳ型胶原而破坏基底膜的完整性。Ⅳ型胶原酶即基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9（MMP-2,MMP-9）又称明胶酶,属基质金属蛋白酶家族,它参与调控ECM的更新,维持细胞的稳定性,已被证明参与肿瘤发生、发展的多个环节,抑制该酶活性就能有效地控制肿瘤发生、发展和转移。因此,针对这一靶点设计、合成明胶酶抑制剂是当前抗肿瘤药物研究发展最快的领域。基于MMP-2,-9结构并分析参比化合物抗瘤酮A10和沙利度胺化学结构特点后,设计合成了以结构狭长空间取向稳定,易进入明胶酶活性中心位点S1’结合腔为特点的一系列环酰亚胺小分子类肽化合物,用于对Ⅳ型胶原酶抑制活性的筛选和抗肿瘤转移实验。以Ⅳ型胶原酶为靶点,在对化合物活性筛选的基础上,我们对化合物4i进行了重点研究。实验方法:化合物活性筛选实验,以琥珀酰明胶降解法检测化合物对人Ⅳ型胶原酶活性抑制作用;以MTT法检测化合物对人卵巢上皮癌细胞SKOV3生长的影响,评价其对细胞的作用性质;以SDS-PAGE明胶酶谱分析SKOV3细胞培养上清液MMP-2,-9水平,评价化合物对酶活性的影响。研究化合物4i抗肿瘤细胞侵袭与转移作用,分别以MTT和细胞克隆生长实验法观察其对SKOV3生长抑制作用;以台盼蓝染色法,检查化合物处理细胞蓝染细胞比例,评价化合物对肿瘤细胞抑制作用性质。以MTT法评价肿瘤细胞与基底膜蛋白的黏附能力。在观察4i对MMP-2和MMP-9活性实验方面,我们分别以明胶酶化学法分析4i对人Ⅳ型胶原酶的抑制作用;以明胶酶谱法分析培养细胞上清液MMP-2,-9活性;以Western blot法检测肿瘤细胞pro-MMP-2和MMP-2,-9表达水平;以免疫细胞化学法检测肿瘤细胞表达MMP-2,-9水平。我们还分别以RT-PCR法观察了4i对SKOV3细胞表达MMP-2和MMP-9 mRNA的影响。在活性评价方面,以transwell chamber法观察了4i对SKOV3细胞穿过人工基底膜的抑制作用;分别以尾静脉注射肿瘤细胞H22和SKOV3致小鼠肺转移模型,评价4i对体内生长肿瘤细胞转移的抑制作用。另外,实验还以Western blotting法测定了化合物对肿瘤细胞表达血管内皮因子VEGF的影响,并将4i与鸡胚尿囊膜（CAM）直接接触,观察其对微血管生成的抑制作用。结果:环酰亚胺小分子类肽化合物对SKOV3细胞具有较弱的生长抑制作用,与细胞接触72 h,剂量100μg/ml以下时,大多数化合物对肿瘤细胞生长抑制率低于30%;剂量达200μg/ml并持续接触72 h时,最高抑制率为48.54%。琥珀酰明胶法检测化合物对Ⅳ型胶原酶活性的影响,多数化合物具有对Ⅳ型胶原酶活性的抑制作用。以SDS-PAGE酶谱分析法,检测化合物对SKOV3细胞培养液MMP-2和MMP-9活性影响,筛选出了编号分别为4i,4r,pro-13,9+HNEt6,4a,4q的化合物对MMP-2和MMP-9活性抑制作用较强,具有进一步研究的价值,本实验重点研究了化合物4i的药理学活性。与明胶酶直接孵育30 min,化合物4i抑制明胶酶活性的IC50为394.71±1.58ng/ml;与SKOV3细胞接触24 h,4i（5-150μg/ml）对培养上清中MMP-9抑制率分别为12.7,16.9,34.8,63.9和82.53%;对MMP-2抑制率分别为8.3,14.8,25.8,26.9和35.8%。免疫细胞化学法可见4i明显减少肿瘤细胞MMP-2,MMP-9表达率,抑制率分别达到78.77%和75.21%。以Western blotting分析发现该化合物对pro-MMP-2,MMP-2,MMP-9表达抑制作用较明显（P＜0.05）,并呈现量效依赖关系。观察化合物是否干扰肿瘤细胞MMP-2,-9 mRNA表达功能,以RT-PCR法发现,较高剂量（150μg/ml）对MMP-2,-9的mRNA表达水平抑制作用强,低剂量（50μg/ml）对MMP-9抑制作用弱。与4i接触24 h,SKOV3细胞穿过人工基底膜数量下降,显示具有抑制肿瘤细胞侵袭与游走的能力。以25和100 mg/kg口服给药28 d,4i能够降低肿瘤细胞在小鼠肺形成转移结节数量。对H22肝癌肺结节形成的抑制率为21.1%和353%;对裸鼠微静脉注射入SKOV3细胞肺结节抑制率为46.5%。另外,4i阻止肿瘤细胞与基底膜蛋白的黏附能力,降低肿瘤细胞VEGF表达水平,抑制CAM血管生成。结论:本实验筛选出了环酰亚胺类肽化合物4i,4r,pro-13,9+HNEt6,4a,4q具有抑制MMP-2和MMP-9活性作用,其中4i活性最强。4i可能主要通过降低肿瘤细胞MMP-2,-9活性和表达水平,抑制癌细胞浸润与转移。环酰亚胺类肽化合物4i可能成为抗肿瘤转移候选化合物之一,具有深入研究的价值。