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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp),全球约一半人口感染,我国人群感染率更是高居不下。Hp感染与人类慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关。该菌已被明确列为人类胃癌发生的I类致癌原。而该菌产生的细胞毒素相关蛋白(cytotoxin associated antigen A,Cag A),是已知最重要的毒素之一,被认为是一种细菌性致癌蛋白,成为该领域研究的焦点。已有研究发现Cag A在宿主细胞内可与20余种蛋白相结合,促发一系列细胞信号转导通路的激活,参与调控生长、运动,引起细胞骨架重排,诱导炎症因子释放等,与胃癌密切相关。鉴于虽然已发现了多种的Cag A结合蛋白,但Cag A的致癌机理仍未完全阐明,因此很可能还存在一些目前未知的能与Cag A蛋白相互作用的细胞蛋白。为了更深入研究Cag A的致癌机制,本研究利用酵母双杂交方法筛选与Cag A蛋白相互作用的胃黏膜细胞蛋白,并进一步在体内外确定Cag A蛋白可与该筛查候选蛋白发生相互作用,最后探讨Cag A与候选蛋白相互作用在Cag A致病机制中的影响。本研究第一部分通过酵母双杂交方法筛选与Cag A蛋白发生相互作用的胃黏膜细胞蛋白。为此,首先,构建用于酵母双杂交的p GBKT7-c a g A诱饵载体,并证实其在酵母中可表达B D-C a g A融合蛋白,进一步采用滤纸法定性和液相分析法定量检测证实Cag A蛋白在酵母细胞内不具有反式激活GAL4的功能。而后,从临床标本中提取人胃黏膜总RNA,逆转录、纯化获取ds c DNA,并将其与线性质粒p GADT7-Rec共转化酵母细胞,构建获得达到酵母双杂交文库要求的人胃黏膜c D N A文库。最后,应用酵母双杂交技术筛选人胃黏膜c D N A文库,共得到4种与Cag A相互作用的胃黏膜细胞蛋白,即:PGA3、e EF1A1、Y WH A E和β-A c t i n。在对上述4种蛋白功能分析的基础上,本研究的第二部分选择Y WH A E蛋白进行进一步研究,旨在探讨C a g A与Y W H A E的相互作用对Cag A致病作用的影响。为此,首先,依次通过一对一酵母双杂交回复验证实验,GST-pull down体外沉淀技术和免疫共沉淀实验,分别证实Cag A可以和YWHAE在酵母细胞内、体外和哺乳动物细胞内发生直接相互作用。而后,通过共转染p CMVTNT-cag A和p C M V T NT-Y WH A E或Y WH A E s i R N A,利用萤火虫荧光素酶报告实验表明Cag A可通过与YWHAE相互作用激活细胞NF-κB,利用细胞上清ELISA检测实验表明Cag A可通过与YWHAE相互作用诱导细胞分泌IL-8。提示Cag A通过与YWHAE的相互作用,细胞YWHAE参与了Hp Cag A的致病。