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白虎加桂枝汤（BHGZT）是源于张仲景《金匮要略》中治痹的经典方剂,由桂枝、石膏、知母、炙甘草和粳米组成,具有清热泻火、通络止痛的功效。临床多应用于类风湿关节炎（RA）、痛风性关节炎和小儿咳嗽等急证的治疗,尤其适用于热痹。目前,对BHGZT整方的物质成分研究较少,多集中在方中所含单味药化学成分的研究上。此外,这个方剂在临床的应用虽广,但相关机制研究较少。针对存在的问题,本研究拟采用超高效液相色谱与飞行时间质谱联用（UFLC-Triple TOF-MS/MS）技术定性解析BHGZT的体内外物质基础,并评估药效,同时通过网络药理学研究方法,将药物靶标预测、网络分析和实验验证相结合,初步探讨BHGZT基于寒药性的功能作用。方法:1.BHGZT体外物质基础研究:1.1建立BHGZT液质检测条件:采用Phenomenex C18色谱柱,以含0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱;采用高分辨三重四级杆飞行时间质谱,分别在正、负离子模式下进行检测;1.2 BHGZT成分解析方法:借助Peakview软件中Formula Finder功能计算化合物的元素组成,调用软件中IDA explore功能,获得该质量数的二级碎片离子信息,结合文献数据和对照品数据比对进行化合物结果鉴定。2.BHGZT血清药物化学分析:2.1考察最佳采血时间点:雄性 SD 大鼠灌胃 BHGZT,给药 0min、15min、30min、1 h、2h、4h、8h、10h眼眶取血,血清样品经蛋白沉淀处理后按方法1.1检测;2.2入血成分解析方法:使用Peakview软件,同时处理空白血清和含药血清质谱数据,提取离子分子峰,再获得该质量数的二级碎片离子。通过对比分析判断血清中化合物是否源于BHGZT。3.BHGZT药效评估3.1建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型:SD大鼠,除Control组外其余大鼠采用Ⅱ型胶原（Ⅱ type collagen,CⅡ）尾部皮内注射诱导的CIA大鼠模型。3.2动物分组、给药和取材:SD雄性大鼠56只,随机分为7组,每组8只。组别分别为Control组、Model组、MTX 0.2mg/kg 组、BHGZT 5.4 g/kg 组、BHGZT 10.7 g/kg 组、BHGZF 10.7 g/kg组、BHGZT 21.4 g/kg组（分别为临床剂量的0.5倍、1倍、2倍）。第一次免疫后连续给药24天,第25天处死动物取材。3.3关节炎评价方法:观察并记录各组大鼠临床红肿症状,采用双盲法评价疾病的严重程度,包括临床积分、关节发病率、体重增长变化三个指标。采用苏木精—伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）、微计算机断层扫描技术（Micro computed tomography,micro-CT）检测BHGZT对CIA大鼠关节破坏的影响。4.BHGZT干预RA-热证的网络靶标预测及验证:4.1 BHGZT干预RA-热证的网络靶标预测4.1.1数据的收集和整理:基于BHGZT实测得到的成分及台湾中医药数据库（TCM Database@Taiwan）收集的已知的BHGZT五味中药所含的化学成分;PubMed、CNKI数据库中搜索含有“RA”、“热证”关键词的中英文文献,从中提取有实验证据的RA热证相关基因;4.1.2 BHGZT所含成分候选靶标预测及关键靶标的筛选:利用本课题组已经建立的中药靶标预测系统,获得BHGZT所含成分的候选靶标;基于String数据库提取上述候选靶标基因之间的互作信息,构建候选靶标基因互作网络,筛选BHGZT的关键候选靶标;4.1.3 BHGZT发挥寒药性功效的相关网络靶标预测及RA热证相关基因-BHGZT关键候选靶标互作网络的构建;4.1.4基于GO、KEGG数据平台对BHGZT发挥功能药性相关通路进行生物学意义诠释;4.2 BHGZT对所预测的功能药性靶标的调控作用的实验验证4.2.1 BHGZT对CIA大鼠踝关节组织ADCY3、PPAR-γ mRNA表达的调节作用:建立CIA大鼠模型,经BHGZT干预24天后取大鼠右后肢踝关节,液氮研磨后提取RNA,采用q-PCR检测ADCY3、PPAR-γ mRNA的表达水平,验证上述网络分析结果。4.2.2 BHGZT干预RA炎症和脂肪相关通路下游效应因子:采用TNF-α诱导人源HFLS-RA细胞模型,将BHGZT进行干预,采用q-PCR检测白介素IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达水平,验证上述网络分析结果。结果:1.BHGZT体外物质基础研究:通过精确相对分子质量的质谱裂解规律,定性BHGZT的35个化合物,包括甾体皂苷类16个、三萜皂苷类6个、黄酮类7个、有机酸类4个和其他类2个,其中10个成分（知母皂苷AⅢ,知母皂苷Ⅰ,知母皂苷BⅢ,知母皂苷BⅡ,新芒果苷,芒果苷,芹糖甘草苷,甘草苷,甘草酸和肉桂酸）通过与对照品比对确认,并对化合物的药材来源进行归属。1.BHGZT血清药物化学分析:2.1通过对比不同采血时间含药血清谱,结果表明给药后1 h的血清样品中,BHGZT的血中移行成分组最多,且各色谱峰的响应值较高,最适于分析;2.2通过对比空白血清、含药血清、BHGZT药液的指纹图谱,共鉴定出25个血中移行成分。主要是在负模式下检测出,其中14个黄酮类成分,7个知母皂苷类成分,3个有机酸类成分和1个三萜皂苷类成分。2.BHGZT药效评估:3.1成功建立CIA大鼠模型,Model组发病率100%,表现为精神萎靡不振,食欲减退,体重下降,伴有轻度脱毛和腹泻,同时伴有尾根部溃疡并逐渐自愈,并同时出现累及四肢远端小关节的肿胀,以后逐渐加重,致行动迟缓、跛行;病理切片结果显示Model组关节结构遭到破坏,镜下可观察到有大量的炎性细胞浸润,滑膜异常增生,大量血管翳形成,软骨下骨小梁排列紊乱,结构疏松;Micro-CT影像学分析显示Model组大鼠的关节外形不完整,表面凹凸不平,骨组织稀疏。3.2实验结果表明,BHGZT各剂量组给药后可显著改善CIA大鼠的关节炎症状,降低关节炎临床积分和发病率,并延长首次发病时间;此外,可改善关节组织病理情况,Micro-CT的检测结果也表明BHGZT能显著降低CIA大鼠软骨和骨损伤程度。3.BHGZT干预RA-热证的网络靶标预测及实验验证4.1 BHGZT干预RA-热证的网络靶标预测4.1.1基于构建的化学成分库预测得到1312个候选靶标;4.1.2建立BHGZT候选靶标基因互作网络,筛选网络节点连接度大于2倍中位数的节点为BHGZT的关键候选靶标,共计309个;4.1.3建立热证RA相关基因-BHGZT候选靶标基因-互作网络,通过连接度、节点介度、节点紧密度三个拓扑特征值的筛选,得到79个BHGZT干预热证-RA关键候选靶标;4.1.4对79个关键候选靶标进行生物学功能诠释,发现BHGZT主要作用于糖脂能量代谢和炎症免疫两大方面。其中,ADCY3和PPAR-γ显著富集于cAMP信号通路,且ADCY3是知母和桂枝的候选靶标,此外cAMP信号通路与脂肪调节和机体寒热调节相关性较强;IL-1β、IL-6和IL-8三个细胞因子是免疫炎症和能量代谢通路的共同效应因子,在BHGZT干预热证-RA的网络调控中发挥重要作用,是关键候选靶标;4.2 BHGZT网络靶标验证实验:4.2.1 BHGZT对CIA大鼠踝关节组织ADCY3、PPAR-γ mRNA表达的调节作用:与Control组大鼠相比,Model组大鼠踝关节组织ADCY3、PPAR-γ mRNA异常上调（p<0.001）;BHGZT各剂量组均能下调ADCY3、PPAR-γmRNA的表达,其中BHGZT 5.4g/kg组和BHGZT 21.4g/kg组显著降低ADCY3 mRNA的表达（P<0.01）,BHGZT 5.4g/kg 组和 BHGZT 21.4g/kg 组显著降低 PPAR-γ mRNA 的表达（P<0.05,P<0.01）。4.2.2 BHGZT干预RA炎症和脂肪相关通路下游因子:通过采用体外培养的TNF-α诱导HFLS-RA细胞体系对BHGZT干预热证-RA的关键候选靶标进行验证,发现HFLS-RA细胞经过TNF-α诱导24 h后,能显著上调IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达（P<0.01）,而BHGZT给药能有效抑制由TNF-α诱导异常升高的这三个效应因子的基因表达水平。结论:1.本研究采用UFLC-Triple-TOF-MS/MS对BHGZT全方化学成分和入血成分进行定性分析,体外确证了 BHGZT中35个化合物,包括16个甾体皂苷类、6个三萜皂苷类、7个黄酮类、4个有机酸类和2个其他类,其中甾体皂苷源自于知母,黄酮类主要源自于炙甘草,有机酸类主要源自于桂枝;体内确证了 16个原型入血成分,9个代谢型成分。相关研究结果为BHGZT这一经典名方的药效物质基础研究、质量控制以及作用原理阐释提供了参考,也表明了 UFLC-Triple TOF-MS/MS法有利于更简便、快速、全面地定性分析中药方剂中的化学成分;2.本研究成功建立了 CIA模型大鼠,发病率达到100%,关节病变明显且与临床接近;明确了 BHGZT能有效延缓CIA大鼠首次发病时间,改善关节红肿,降低关节炎临床积分,改善关节骨破坏情况。3.本研究采用网络药理学研究策略,通过药物候选靶标的预测、病证相关基因-药物候选靶标互作网络的拓扑特征计算及靶标生物学功能阐释,揭示了 BHGZT改善热证RA的相关通路主要作用于糖脂能量代谢和炎症免疫两方面;其中ADCY3和PPAR-γ显著富集于cAMP信号通路,IL-1β、IL-6和IL-8三个细胞因子是针对炎症免疫和能量代谢通路的共同效应因子,在BHGZT干预热证-RA的网络调控中发挥重要作用。4.本研究对预测到的网络靶标进行体内外实验验证,发现BHGZT能调节CIA大鼠炎症关节中ADCY3和PPAR-γ mRNA的表达,同时也能下调IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA在TNF-α诱导的HFLS-RA细胞中的表达,表明了 BHGZT能够通过负调节ADCY3、PPAR-γ、IL-1β、IL-6和IL-8等因子的基因表达,从而调控糖脂能量代谢和炎症免疫失衡发挥抗RA作用,为BHGZT这一热痹经典名方功效药性的阐述提供初步的生物学基础。综上,本研究采用UFLC-Triple TOF-MS/MS技术定性解析BHGZT的体内外物质基础,同时通过网络药理学研究策略,初步探讨了 BHGZT基于寒药性的功能作用,为BHGZT这一经典名方的药效物质基础研究、质量控制以及作用原理阐释提供参考。