一、文献研究本部分是在对相关文献进行整理的基础上,系统综述了苦豆子植物的资源学、资源化学及其资源性化学成分生物活性的研究现状,在此基础上提出了本论文的研究思路与实验方案。二、苦豆子植物根茎资源化学成分研究基于对苦豆子植物资源综合利用价值发现的目的,采用硅胶及聚酰胺柱层析等色谱技术对苦豆子SophoraalopecuroidesL.地下根茎部分所含化学成分进行分离、纯化,根据其理化性质及波谱数据鉴定其结构。结果从苦豆子根茎的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中共分离鉴定了 13个化合物,其中7个为生物碱类成分,分别为:氧化槐果碱(1)、氧化苦参碱(2)、苦参碱(3)、槐果碱(4)、槐胺碱(5)、槐定碱(6)、野靛碱(7);6个黄酮类成分:alopecurone A(8)、alopecurone B(9)、sophoraflavanone G(10)、leachianone A(11)、isokurarinone(12)、kushenolF(13)。研究结果为苦豆子根茎资源的利用提供了基础。三、苦豆子植物资源化学评价研究(一)生物碱类成分资源化学评价1苦豆子种子中生物碱类成分的分布规律采用UPLC-TQ-MS方法,建立了同时测定苦豆子种子中7种生物碱类成分的方法,并应用该方法对苦豆子种子不同部位(种皮和子叶)的生物碱类成分的分布规律进行了研究。结果显示:子叶中的7种生物碱的总含量(38.52 mg/g)比种皮(6.40 mg/g)中高,氧化苦参碱、氧化槐果碱和野靛碱的含量在子叶中是最丰富的,并且比在种皮高8-12倍。种皮中的苦参碱和槐定碱的含量略高于子叶。结果表明,苦豆子种子中的生物碱主要分布在子叶中。此外,各种生物碱的百分比含量在子叶和种皮中有较大差别。氧化苦参碱在子叶中的百分比最高(32.6%),而槐定碱在种皮中的百分比最高(33.4%)。2苦豆子不同部位、不同物候期生物碱类成分动态积累规律采用HILIC-UPLC-TQ-MS技术,建立了同时测定苦豆子植物中7种生物碱及赖氨酸的方法,并应用该方法对苦豆子不同部位、不同物候期21个样品中生物碱及赖氨酸的动态积累规律进行了研究。分析结果显示在苦豆子6-10月的生长期中,7种生物碱总量均值在其各个植物器官中的排序为:种子>叶>根>茎>果荚,且7种生物碱总量在茎、叶、果荚中逐渐下降,在种子中逐渐上升至9月;氧化苦参碱、氧化槐果碱是所测生物碱中在不同物候期不同植物器官中含量始终最高的两个成分;通过建立简单的数学模型表示赖氨酸与生物碱的动态积累关系。(二)黄酮类成分资源化学评价采用紫外-可见分光光度法,对苦豆子不同部位、不同物候期21个样品中总黄酮含量进行了比较研究,结果显示:苦豆子在6-10月生长期中,不同部位总黄酮的平均含量根(2.27%)>叶(2.01%)>茎(0.69%)>种子(0.59%)>果荚(0.31%);苦豆子根、茎、叶中总黄酮含量随生长期逐渐升高,趋势一致,而苦豆子果荚总总黄酮含量随生长期逐渐降低,表现出与其他器官相反的变化趋势,苦豆子种子总黄酮含量随生长期变化较小,趋势平稳。(三)氨基酸类成分资源化学评价采用HILIC-UPLC-TQ-MS技术,建立了快速、灵敏,且不经衍生化直接发现并测定20种游离氨基酸类成分的分析方法,并应用于苦豆子植物不同部位、不同物候期21个样品的测定。结果显示,苦豆子植物中富含游离氨基酸类成分,其含量因不同部位、不同物候期存在较大差异,同一物候期不同植物器官中游离氨基酸含量变化较大,如:9月根中20种氨基酸总含量22.45 mg/g,9月果荚中20种氨基酸含量3.30 mg/g,同一器官不同物候期中游离氨基酸含量变化较大,如:6月茎中20种氨基酸含量48.55 mg/g,10月茎中20种氨基酸含量4.83 mg/g;除必须氨基酸在含量丰富外,在样品中还检测到非蛋白氨基酸:Y-氨基丁酸、羟脯氨酸和瓜氨酸。此外,还对氨基酸成分的相对定量方法进行了评价及准确度的验证。(四)核苷类成分资源化学评价采用HILIC-UPLC-TQ-MS技术,建立了核苷、碱基及核苷酸类成分的分析方法,并应用于苦豆子植物不同部位、不同物候期21个样品的测定。分析结果显示多数核苷、碱基类成分均伴随苦豆子生长发育全过程,但两种核苷酸类成分没有检测到;此类化合物随苦豆子植物生长过程表现出一定的规律性,在苦豆子根茎6-10月的生长期中,鸟嘌呤、胞苷含量逐渐降低;在苦豆子叶6-8月的生长期中,鸟嘌呤、胞苷含量逐渐升高,肌苷的含量逐渐降低;在苦豆子果荚7-10月的生长期过程中,鸟嘌呤含量逐渐降低;在苦豆子种子7-10月的生长期中,9月达到最大含量的有黄嘌呤,而大部分此类成分在8月达到峰值,这与生物碱的动态变化规律略有不同。(五)多糖类成分资源化学评价采用紫外-可见分光光度法,分别以葡萄糖醛酸和葡萄糖为对照品,对苦豆子不同部位、不同物候期21个样品中酸性多糖及中性多糖含量进行了比较研究。结果显示:苦豆子在6-10月生长期中,不同部位酸性多糖的平均含量叶(16.75%)>茎(13.03%)>根(12.91%)>果荚(11.94%)>种子(7.58%),不同部位中性多糖的平均含量叶(13.68%)>根(12.91%)>种子(11.74%)>茎(10.09%)>果荚(9.61%)。(六)无机元素资源化学评价采用ICP-AES法,对苦豆子不同部位、不同物候期21个样品中29种无机元素含量动态积累规律进行了研究。结果显示:无机元素在植物中分布具有一定规律:Ca、Cu、Mn主要分布在叶中,如Ca在叶中所占比例的均值为59.6%;Na主要分布在茎中,其在茎中所占比例的均值为58.3%;Zn、P、K主要分布在种子中,如Zn在种子中所占比例的均值为66.3%。无机元素不仅在植物不同器官的分布有所差异,而且在各器官的不同物候期中呈一定变化规律:Ca含量在果荚中伴随生长期有升高的趋势,Zn含量在叶中伴随生长期有下降的趋势等。四、生物碱提取技术的研究(一)超声辅助提取生物碱类成分的比较研究及工艺优化1乙醇超声辅助提取生物碱类成分的工艺优化采用响应曲面法,同时以7种生物碱提取率为评价指标,研究乙醇比例、提取时间、液固比提取因素,在提取苦豆子中生物碱过程中所产生的影响,建立回归方程优化提取工艺参数。结果表明:62.22%(乙醇比例),70.00min(提取时间)和125.52ml/g(液固比)的条件下,可获得最大提取率,分别为:槐果碱(387.32μg/g)、氧化槐果碱(9731.39μg/g)、氧化苦参碱(9400.16μg/g)、苦参碱(421.58μg/g)、槐胺碱(315.73μg/g)、槐定碱(7103.59μg/g)、野靛碱(7751.33μg/g)。2酸水超声辅助提取生物碱类成分的工艺优化采用响应曲面法,同时以7种生物碱提取率为评价指标,研究pH值、提取时间、液固比提取因素,在提取苦豆子中生物碱过程中所产生的影响,建立回归方程优化提取工艺参数。结果表明:2.3(pH值),66.95min(提取时间)和115.70ml/g(液固比)的条件下,可获得最大提取率,分别为:槐果碱(395.32μg/g)、氧化槐果碱(12383.53μg/g)、氧化苦参碱(12256.97μg/g)、苦参碱(419.52μg/g)、槐胺碱(316.69μg/g)、槐定碱(8173.94μg/g)、野靛碱(8363.42μg/g)。(二)超声-酶法联用辅助提取生物碱类成分的比较研究及工艺优化采用响应曲面法,同时以7种生物碱提取率为评价指标,研究pH值、提取温度、提取时间、液固比提取因素,在提取苦豆子中生物碱过程中所产生的影响,建立回归方程优化提取工艺参数。结果表明:5.12(pH值),53.96℃(提取温度),59.74min(提取时间)和112.01ml/g(液固比)的条件下,可获得最大提取率,分别为:槐果碱(410.46μg/g)、氧化槐果碱(15377.73μg/g)、氧化苦参碱(14635.47μg/g)、苦参碱(422.18μg/g)、槐胺碱(325.36μg/g)、槐定碱(9864.06μg/g)、野靛碱(9222.39μg/g)。五、苦豆子植物资源利用研究(一)苦豆子资源性成分降血糖功能的初步评价研究选择四氧嘧啶造糖尿病模型小鼠,以小鼠血糖、糖耐量以及血清中TC、TG、ALT、AST、BUN、SCR的含量为考察指标,对苦豆子植物总黄酮、总多糖、总生物碱干预糖尿病小鼠及其并发症功能进行了研究。结果显示:与模型组比较,苦豆子总多糖能够显著降低模型小鼠血糖值,提高糖尿病小鼠糖耐量,并且可显著降低糖尿病小鼠血清中TC、TG水平,显著降低肝脏、肾脏指数以及血清AST、ALT、BUN、SCR指标,缓解糖尿病小鼠肝脏、肾脏病变。苦豆子总黄酮高剂量的情况下可以显著降低模型小鼠血糖值,并可降低模型小鼠血清TC、TG水平,显著降低肝脏指数以及血清AST、ALT指标,缓解糖尿病小鼠肝脏病变。苦豆子总生物碱虽然在本实验中没有表现出降血糖的作用,但发现其可以改善糖尿病小鼠血脂水平。以上结果表明苦豆子总多糖、总黄酮、有明显的降血糖作用,并且对糖尿病肝肾并发症有一定改善,此结果对苦豆子资源性成分的有效开发及利用提供了新的思路及参考。(二)苦豆子资源性成分降血脂功能的初步评价研究选择高脂饲料造高脂血症模型小鼠,以小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、BUN、SCR、MDA的含量为考察指标,对苦豆子植物总黄酮、总多糖、总蛋白降血脂功能进行了研究。结果显示:与模型组比较,苦豆子总多糖、总黄酮能够显著降低模型小鼠血清TG、TC,显著升高HDL-C含量,并且可以降低MDA含量,显著降低肝脏指数以及血清AST、ALT指标,缓解高脂血症小鼠肝脏病变。苦豆子总蛋除不能降低血清中TC含量外,在其他指标反应上与总多糖、总黄酮作用趋势一致。以上结果说明苦豆子总多糖、总黄酮、总蛋白有明显的降血脂作用,对防治高脂血症和脂肪肝的发生、发展有积极意义。