背景：骨盆环包括双侧髂骨、坐骨、耻骨及骶骨所形成的一个骨性环状结构。有相当数量的骨肿瘤发生于此区域：它是全身软骨肉瘤最好发部位。软骨肉瘤在所有原发恶性骨肿瘤中所占比例约为25%,是目前最常见的原发恶性肿瘤之一。软骨肉瘤细胞产生透明软骨成分为其主要病理特征。软骨肉瘤的恶性程度相对较低,5年生存率约为55%-72%。其生长生长较缓慢,但也不排除转化为其它恶性程度较高的骨肿瘤,如骨肉瘤、纤维肉瘤的可能性。在所有骶骨原发骨肿瘤中,软骨肉瘤是常见的病理类型之一。骶骨软骨肉瘤多发生在上位骶骨,发病隐匿,症状常不明显,因其发病部位特殊,X射线、CT扫描检查存在一定难度,所以其早期诊断较为困难,发现时往往瘤体已经巨大,其主要临床表现包括神经功能受损,以及疼痛等。由于其早期主要累及神经系统,所以常被误诊为腰痛或腰间盘突出等。软骨肉瘤对于放、化疗均不敏感,因此手术切除是目前治疗骶骨软骨肉瘤的主要治疗手段。但是骶骨解剖位置复杂,毗邻重要的血管、腹腔脏器和骶神经,这使骶骨软骨肉瘤手术切除范围受到很大的限制。而且骶骨是和腰椎相连的骨骼,起到传导应力的作用,同时骶骨也是骨盆环的重要组成部分,这使骶骨软骨肉瘤切除后面临重建脊柱-骨盆环稳定性的问题。使骶骨软骨肉瘤的手术治疗面临巨大的挑战。由于目前早期肿瘤治疗效果较为理想,而晚期肿瘤一般预后较差,而且肿瘤靶向治疗也是当前肿瘤治疗的重要手段,因此开发肿瘤分子标记对于肿瘤的治疗具有十分重要的意义。上皮-间质转化(EMT)是胚胎发育,组织修复和疾病发生中的重要细胞机制。在个体发育成熟后,这些发育编程机制的异常激活可以导致各种疾病的发展。器官纤维化和癌症转移过程都由EMT控制,EMT控制癌症转移可能是通过产生癌症干细胞并定植到其它组织,以形成继发性肿瘤。EMT另外还参与纤维化和癌症进程,并参与干细胞样细胞形成,在异位骨化和血管钙化分化成骨祖细胞的形成过程中也发挥重要作用。上皮细胞通过各种细胞粘附分子,如claudins和E-cadherin粘附在一起形成极性细胞层。在这个极性细胞层下面,基底膜将上皮细胞锚定到基质表面上,并通过中间纤维和半桥粒的连接来维持顶端-基底极性。两者基底膜和相邻细胞的粘附对维持上皮形态是非常重要的。在EMT过程中,细胞失去了这些上皮的特点,获得的侵袭和间质转移的能力,使得这些细胞离开组织的实质,并进入体循环造成癌症转移。在某些情况下,cadherin可从E-cadherin转换为N-cadherin,是EMT的重要生物分子标记。此外,波形蛋白的表达增加,以及Snail和Slug也是细胞间充质表型的分子标记。Snail和Slug可以调节钙粘蛋白由“E”向“N”的转变,并启动细胞EMT。因此,EMT途径有可能作为肿瘤治疗的靶向分子并抑制肿瘤的转移过程。肿瘤细胞的侵袭,血管生成和转移过程受到许多相互交织重叠的分子通路的调控。趋化因子及其受体是该过程的重要分子,其参与细胞运动,迁移和增殖。到目前为止,EMT诱导的SDF-1/CXCR4已被证实在多种癌症的侵袭和转移中发挥重要作用。SDF-1/CXCR4通过介导肿瘤细胞的增殖和迁移,以及增强肿瘤相关的血管生成间接促进肿瘤转移。Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员,其表达具有很强的时空特异性,只在胚胎和肿瘤组织中表达,并可能在肿瘤抗药性中发挥重要作用,大多数癌组织的Survivin表达都发生改变,而且受细胞周期的高度调节对细胞周期进程具有重要调节作用。survivin的生物效应主要包括抑制细胞凋亡,定位有丝分裂染色体,以及促进细胞的活动和转移。Survivin在细胞分裂中的重要作用目前已经得到承认。多种方法和多种细胞类型的有丝分裂缺陷细胞都已经证明了这一点。Survivin在正常细胞的表达表现很强的细胞周期依赖性,它在G2/M期的表达急剧升高。然而,在骶软骨肉瘤中CXCR4和Survivin之间的联系还不清楚,SDF-1/CXCR4调节的细胞迁移是否依赖于Survivin等都有待于进一步研究。目的和意义：软骨肉瘤是是目前最常见的原发恶性肿瘤之一,严重影响人们的生活质量,且早期诊断困难,治疗方法单一。目前关于软骨肉瘤,尤其是骶软骨肉瘤的研究还十分匮乏,且主要集中在肿瘤的临床分期及治疗手段上,关于骶软骨肉瘤的早期诊断,肿瘤的生物分子标记,发病机理以及肿瘤的靶向治疗方面的研究还很少,而这些恰恰是从源头上治愈肿瘤,杜绝肿瘤复发的关键问题。因此本研究将从分子角度入手,着重关注CXCR4和Survivin两个分子在软骨肉瘤细胞EMT以及细胞周期调节中的作用,通过CXCR4和：Survivin将肿瘤发生过程的重要信号通路,包括EMT、MEK/ERK和PI3K/AKT通路以及细胞周期调控有机地结合在一起,初步探讨了两者在骶软骨肉瘤发生和转移过程中的作用,为骶软骨肉瘤的早期诊断以及免疫治疗提供了可能的靶点和新的可能的治疗方法。方法：随机抽取来自2008年1月至2014年6月在南方医科大学南方医院和山东大学齐鲁医院就诊的30位患者的病理组织材料。首先对所有样品材料进行切片和免疫组化,检测指标为CXCR4和Survivin在所有样品中的表达情况,包括蛋白在细胞内的表达位置以及其表达强度,然后采用回顾分析的方法,将CXCR4和Survivin的表达情况与各个样本的临床特征进行对应分析,从而得出CXCR4和Survivin的表达与各临床特征之间的关系；随后利用western blot和定量PCR分别检测了不同浓度梯度和不同时间点SDF-1处理后,软骨肉瘤细胞系SW1353细胞中Survivin蛋白质和mRNA的表达量的变化；使用激酶抑制剂分别阻断SW1353细胞的MEK/ERK和PI3K/AKT通路,检测SDF-1诱导的survivin蛋白表达水平的变化；接下来,我们利用survivin siRNA转染SW1353细胞,来降低survivin的mRNA水平并进一步降低survivin的蛋白表达,利用流式细胞仪检测survivin降低后对细胞周期进程的影响；最后,利用Western blot检测20 ng/ml SDF-1处理后,对照组和survivin siRNA转染SW1353细胞中Snail和N-cadherin的表达水平。结果:CXCR4蛋白主要在骶软骨肉瘤细胞的细胞膜和细胞质部分表达,Survivin蛋白主要定位于骶软骨肉瘤细胞的细胞核和细胞质中,两者在亚细胞定位上具有一定的空间重叠。30位患者及其各自的CXCR4和Survivin表达情况与临床特征统计分析结果显示,Survivin蛋白的在骶软骨肉瘤组织中的阳性表达率为87.6%(26/30),CXCR4在骶软骨肉瘤组织中的阳性表达率为83.3%(25/30)。另外,在高分化骶软骨肉瘤患者中,CXCR4的阳性表达比例为73%,在重度骶软骨肉瘤患者中,CXCR4的阳性表达比例为84%；同时,在轻度患者中,Survivin蛋白的阳性表达比例为73%,中重度患者为84%,CXCR4和Survivin蛋白表达情况高度一致。更重要的是,Western结果发现CXCR4和Survivin在重度骶软骨肉瘤组织中的表达水平显著高于轻度组织,表明CXCR4和Survivin和骶软骨肉瘤的严重程度密切相关。CXCR4和Survivin的表达与骶软骨肉瘤的严重程度有关。在中重度骶软骨肉瘤(Ⅱ,Ⅲ级)组织内,CXCR4阳性比例为100%(16/16),而在轻度组织内,CXCR4阳性比例为64.3%(9/14)。正如预期的那样,Survivin在中重度骶软骨肉瘤(Ⅱ,Ⅲ级)和轻度(Ⅰ级)组织内阳性表达比例分别为100%(16/16)和71.4%(10/14)。与轻度骶软骨肉瘤相比,中重度骶软骨肉瘤组织的CXCR4和Survivin表达比例显著升高,具有统计学意义(P<0.05)。另外,我们也统计了CXCR4和Survivin与骶软骨肉瘤复发之间的关系。在所有复发病例中,CXCR4和Survivin的阳性表达比例均为100%(15/15)。在未发生复发的病例中,CXCR4阳性表达比例为67%(10/15),Survivin的阳性表达比例为73%(11/15)。统计结果显示CXCR4 (P=0.014)和Survivin (P=0.032)的表达在复发与未复发病例中所占比例有显著差异,其与骶软骨肉瘤复发之间直接相关。western blot结果显示随着SDF-1蛋白处理浓度的提高,由0升高到10,20ng/ml, Survivin蛋白的表达也随之升高,但50ng/ml和20ng/ml SDF-1处理后Survivin表达量没有显著差异,表明当SDF-1达到20ng/ml时其对Survivin蛋白的诱导表达作用即达到饱和,所以除非另有说明,以后的SDF-1体外处理浓度都选用20ng/ml。体外使用20ng/ml SDF-1处理SW1353细胞,分别在处理0,2,4,8,12,和36小时后取材进行Western检测。结果表明,随着处理时间的延长,0,2,4,8小时处理后, Survivin蛋白的表达量逐渐升高,但处理8,12,36小时后Survivin蛋白表达量没有明显变化,表明20ng/ml SDF-1处理8h后,其对Survivin蛋白的诱导作用即达到饱和。以上结果说明SDF-1对Survivin的诱导作用是剂量和时间依赖性的。定量PCR显示SDF-1诱导后Survivin mRNA也表现出类似的结果。在研究SDF-1对survivin的上调作用是否依赖于MEK/ERK和PI3K/AKT通路的试验中,结果发现,与DMSO处理对照组相比,U0126(P=0.024)和LY294002(P=0.0293)可以显著降低SW1353细胞中SDF-1对survivin蛋白的诱导水平。这表明在体外细胞试验中SDF-1对survivin蛋白的诱导作用是依赖于MEK/ERK和PI3K/AKT途径的。随后构建了survivin siRNA转染的SW1353细胞系,转染后细胞内的survivin蛋白水平显著下降。与对照组相比,siRNA转染诱导survivin表达水平降低后,可以显著抑制细胞周期蛋白D1及CDK2的表达,表明survivin可以影响细胞周期进程。我们进一步使用流式细胞术对对照组和转染后细胞所处细胞周期比例进行了分析,结果发现与单独使用SDF-1处理和对照组相比,survivin siRNA显著降低了SW1353细胞中S期细胞所占比例。处理24h后,与对照组的23.5%相比,survivin siRNA转染组的S细胞只占总细胞数的6.2%(Df=2,χ2=6.73,0.01<P<0.05)。为了确定SDF-1对survivin的诱导作用是否对EMT产生影响,我们检测了20 ng/mlSDF-1处理后,对照组和survivin siRNA转染SW1353细胞中Snail和N-cadherin的表达水平。我们利用western分别检测了SDF-1处理后不同时间点的Snail和N-cadherin的表达水平,在对照组中,Snail和N-cadherin的表达水平显著受到SDF-1的调节,随着处理时间的延长而发生上调,而在survivin siRNA转染细胞中,随着SDF-1处理时间的延长,Snail和N-cadherin的表达显著下调,这说明,SDF-1对于Snail和N-cadherin水平的调节是依赖于survivin蛋白的。结论：首先利用免疫组化的方法证明了CXCR4蛋白主要在骶软骨肉瘤细胞的细胞膜和细胞质部分表达,Survivin蛋白主要定位于骶软骨肉瘤细胞的细胞核和细胞质中,且CXCR4和Survivin蛋白在骶软骨肉瘤组织细胞内的阳性表达率很高,另外两者的表达和骶软骨肉瘤的严重程度,复发情况有非常显著的对应关系,与年龄、性别差异无关,因此CXCR4和Survivin蛋白的高表达有可能可以作为骶软骨肉瘤的生物分子标记应用于骶软骨肉瘤的早期检测。western blot和定量PCR结果显示随着SDF-1蛋白处理浓度的提高和处理时间的延长,Survivin的蛋白和mRNA表达也随之升高。表明Survivin的蛋白和mRNA水平都受到SDF-1/CXCR4的活性的影响。说明SDF-1/CXCR4在Survivin的上游发挥作用,由SDF-1/CXCR4激活的某些组分可以在转录和转录后水平对Survivin的表达水平进行调节,这就将SDF-1/CXCR4通路和Survivin联接到了一起,同时也证明了由SDF-1/CXCR4调控的肿瘤细胞的转移侵袭和由Survivin调控的细胞周期之间是相互联系,相互影响的。MEK/ERK和PI3K/AKT通路抑制剂处理的实验证明了MEK/ERK和PI3K/AKT参与了SDF-1/CXCR4对Survivin的调节作用。我们的研究还证明使用siRNA抑制SW1353细胞的Survivin表达后,可以显著影响细胞的细胞周期,显著减少SW1353细胞G2/M期的比例。而同时Survivin siRNA转染细胞显著抑制了SDF-1诱导的Snail和N-cadherin的表达。而Snail和N-cadherin作为EMT的分子标记,其表达下降表明Survivin蛋白的缺失可以抑制软骨肉瘤的EMT,即SDF-1/CXCR4诱导的细胞EMT是依赖于Survivin蛋白的。SDF-1/CXCR4与Survivin蛋白之间的相互作用表明EMT和细胞周期是一个相互影响的过程,两个过程间可以互相协调,相互影响,在调控骶软骨肉瘤细胞的侵袭、转移和复发过程中发挥重要作用。我们的研究为骶软骨肉瘤的早期诊断提供了新的分子靶点,同时为其靶向治疗提供了可能的分子靶点。