细胞凋亡是细胞内在自杀程序被激活的结果，参与许多重要的生理过程，如组织稳态、胚胎发育和免疫应答等。糖基转移酶是细胞内负责糖链加工的蛋白质。半乳糖基转移酶是糖基转移酶家族中的一个亚类，以UDP－半乳糖苷为糖基供体。β1，4－半乳糖基转移酶I (β-1,4-GalT-I)是最早被克隆的一种糖基转移酶。有研究发现，β-1,4-GalT-I的表达与细胞凋亡有关。蛋白激酶B(PKB/Akt)于1991年被克隆，是一个近60kD的丝/苏氨酸蛋白激酶，活化PKB/Akt能抵抗多种方式的细胞凋亡。p58PITSLRE是用β-1,4-GalT-I的多抗作分离纯化时得到的一个丝/苏氨酸蛋白激酶。此后又发现了一系列与p58PITSLRE具有高度同源性的蛋白质，通称为PITSLRE磷酸激酶，PITSLRE激酶在细胞凋亡中发挥的作用由其蛋白水解产物p110C介导。本文主要研究了PKB对β1,4-半乳糖基转移酶I调控及p110C与PAK1的相互作用。本文首先用脂质体转染的方法在人肝癌细胞株SMMC7721细胞中超表达持续激活PKB，使其活性增加，观察它对细胞生长和凋亡的影响。结果显示PKB/Akt能够促进细胞生长，使锚定不依赖生长能力增加，S期细胞增多。以往研究表明，加速细胞进入S期依赖cyclin E/cdk2复合物的活性，p27kip1可抑制cyclin E/cdk2复合物形成。本实验发现PKB/Akt可以抑制p27kip1表达，提示S期细胞增多与p27kip1表达减少有关。此外，超表达PKB能够抑制细胞失巢凋亡。糖原合酶3(GSK-3)是最早发现的PKB/Akt的底物，有研究表明整合素相关激酶(ILK) 抑制IEC-18上皮细胞失巢凋亡是磷酸化GSK-3的结果，因此推测GSK-3可能参与PKB/Akt阻止7721细胞失巢凋亡。PKB在促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的同时，抑制β-1,4-GalT-I mRNA的表达及其总酶活性，而不改变β-1,4-GalT-I的细胞表面酶活性。高尔基体上的β-1,4-GalT-I的量远远高于细胞表面的量，因此可以认为我们测出的总酶活性就是高尔基体上β-1,4-GalT-I的活性。高尔基体上的β-1,4-GalT-I主要催化Galβ1-4GlcNAc糖苷键的合成，在许多糖蛋白的N型糖链中存在这一结构，例如，末端半乳糖残基可以作为galectins、 contactinhibin和hepatic lectin等的配体，参与细胞生长、凋亡和血清糖蛋白循环等过程的调节。β-1,4-GalT-I的表达和活性的改变不可避免地会影响存在Galβ1-4GlcNAc糖苷键的糖蛋白的功能，从而促使细胞生存状态的改变。RCA-1 blot检测转染前后细胞表面膜蛋白半乳糖基化的改变。结果显示，gagPKB/7721细胞与对照细胞相比，膜蛋白表达没<WP=5>有明显改变，而膜蛋白的糖链检测Galβ1?4GlcNAc－的表达虽然没有明显降低，但不同分子量的膜蛋白Galβ1?4GlcNAc－的表达不一致。因此我们认为：转染PKB后降低的β-1,4-GalT-I活性，可能仅作用于某些特定的膜糖蛋白，而不影响总的膜蛋白。而RCA-1免疫组织化学染色结果显示，超表达PKB的7721细胞较之对照细胞，染色强度明显降低,表明超表达PKB的细胞蛋白的Galβ1?4GlcNAc－表达下降。这些结果表明PKB对于β-1,4-GalT-I所影响的糖蛋白的调控存在复杂的调节机制。以往的研究表明，细胞表面的β-1,4-GalT-I参与调节细胞生长，而高尔基体上的β-1,4-GalT-I是否参与细胞生长的调控未见报道，因此推测可能PKB促进细胞生长并不依赖PKB对β-1,4-GalT-I活性的调节，而PKB降低β-1,4-GalT-I活性可能参与调节PKB抑制7721细胞失巢凋亡途径。 β-1,4-GalT-I能够受到细胞凋亡途径中的重要分子PKB的调控，这至少部分解释了β-1,4-GalT-I与细胞凋亡之间的联系。此外，已知在用β-1,4-GalT-I的多抗作分离纯化时，得到了一个丝/苏氨酸蛋白激酶p58PITSLRE。p58PITSLRE是PITSLRE激酶家族的一员。现在已经发现的PITSLRE蛋白家族成员超过20个，介导了细胞周期调控，凋亡信号传导和转录的调节等细胞生物学功能。其中对p110PITSLRE 和p58PITSLRE的研究最多。p110PITSLRE在细胞的各个周期都有表达，参与调节RNA的加工和转录。p58PITSLRE是p110PITSLRE基因转录体内部的一个翻译起始位点翻译得到的蛋白质，主要在G2/M期表达，与细胞周期进程的调控有关。p110C是在细胞凋亡过程中有某些PITSLRE激酶家族成员水解得到的产物，它能够诱导细胞凋亡，但p110C在诱导细胞凋亡中发挥作用的机制尚未阐明。我们首先诱导NIH3T3细胞失巢凋亡，然后用针对PITSLRE基序的多克隆抗体检测PITSLRE蛋白的表达，与以往的研究结果相似，诱导细胞失巢凋亡时，也出现了大量p110C的表达。为了寻找p110C参与细胞凋亡的可能机制，我们以p110C为诱饵蛋白，用酵母双杂交技术筛选人胎肝cDNA文库，找到了与p110C结合的蛋白PAK1。p110C与PAK1的相互作用是特异性的，这是因为我们既没有检测到p110C与其它I类PAKs的相互作用，也没有检测到PAK1与其它PITSLRE激酶成员的相互作用。我们构建了PAK1的缺失突变体，用酵母双杂交和GST pull down的方法进一步明确了与p110C相互结合所需的区域位于PAK1的第210-332位氨基酸之间，这一区域包含了PAK1的部分调节结构域和部分激酶结构域，是PAKs同源性最低的部位，因此这可能就是p110C只能与PAK1相互作用的原因。以往的研究表明，只有p58PITSLRE能够和cyclin D3相互作用，而p110PITSLRE 和p110C不