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猪痘病毒(Swinepox virus,SWPV)属于痘病毒科,是猪痘病毒属中的唯一成员,在自然情况下,只感染猪,通常呈良性经过。由于SWPV具有生物安全性和临床安全性好、较大的插入外源基因的能力及能诱导宿主产生良好的保护性免疫保护等优点,故适合作为载体用于开发重组疫苗。兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD)是由兔病毒性出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus,RHDV)引起兔的一种高度接触传染性致死性疾病。目前国内应用的RHD疫苗为组织灭活疫苗,然而基因工程疫苗是未来发展的方向。猪痘病毒可通过皮内接种和口服接种方式感染兔,能产生高水平的抗猪痘病毒抗体;且VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白,与病毒的免疫原性和致病性密切相关。为探讨猪痘病毒载体作为构建重组RHD活载体疫苗的可行性,本研究以猪痘病毒江西分离株JX-20G为亲本病毒,TK基因作为外源基因的插入位点,以EGFP/LacZ为筛选标记,通过同源重组技术,建立了重组猪痘病毒构建的技术平台。在此基础上,构建了表达RHDVVP60蛋白的重组猪痘病毒,并测定了重组VP60蛋白的生物学特性。1.兔病毒性出血症VP60基因的克隆表达根据兔病毒性出血症病毒的VP60基因,设计合成了一对特异性引物,经过RT-PCR扩增,T载体连接和序列分析,结果表明扩增到的VP60核苷酸序列与国内外参考毒株的VP60核苷酸同源性为91.8%-99.8%,氨基酸同源性为97.8%-99.8%。利用原核表达载体pET-32a(+),构建了重组表达载体pET-32(+)-VP60。经镍柱亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示重组蛋白His-VP60大小约为80 ku。以重组蛋白包被酶标板,用RHDV的阴、阳性血清检测,结果表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于RHDV抗体的ELISA检测。2以绿色荧光蛋白为筛选标记构建TK基因缺失猪痘病毒以猪痘病毒江西分离株JX-20G为亲本病毒,TK基因作为外源基因的插入位点,以EGFP为筛选标记,痘苗病毒(Vaccinai virus,VV)P11启动子作为外源基因启动子,构建了一个转移载体pSWE11,并对其进行了 PCR、双酶切和测序鉴定。通过同源重组技术,获得了一株TK基因缺失重组病毒rSWPV-E11。对重组病毒进行了 PCR鉴定、荧光观察和遗传稳定性分析。荧光观察结果显示,重组病毒产生荧光,并表达了绿色荧光蛋白,表明P11启动子可作为重组猪痘病毒启动外源基因的启动子。重组病毒传10代,产生的荧光未发生变化,表明TK基因可作为猪痘病毒JX-20G的外源片段插入位点。3以LacZ基因为筛选标记构建TK基因缺失猪痘病毒以LacZ基因作为筛选标记,P11启动子和P28启动子为外源片段启动子,构建了两个转移载体pSWZ11和pSWZ28,并分别对转移载体进行了 PCR、双酶切和测序鉴定。通过同源重组技术,获得了两株重组病毒rSWPV-Z11和rSWPV-Z28。对重组病毒进行了 PCR鉴定、蓝斑观察和遗传稳定性分析。结果显示,在病毒纯化和筛选过程中,两株重组病毒均产生了蓝斑。重组病毒传10代后,均可产生蓝斑,表明两株重组病毒均有良好的遗传稳定性。4表达RHDV VP60蛋白的重组猪痘病毒的构建为了探索猪痘病毒作为RHD疫苗载体的潜力,构建了 2个转移载体pSWE11-7.5V和pSWE11-28V。通过同源重组技术,获得了两株重组病毒rSWPV-E11-7.5V和rSWPV-E11-28V。对重组病毒进行了 PCR鉴定、遗传稳定性分析、电镜观察和Western blotting分析。重组病毒传10代后,产生的荧光均未发生变化。电镜观察结果显示,两株重组病毒在形态和结构上与亲本病毒一致,未发生变化。Western blotting分析结果显示,两个重组病毒均表达产生了 VP60蛋白,大小约为60 ku,均能与RHDV高免血清发生反应,表明重组蛋白均具有良好的反应原性。本研究构建的表达兔瘟病毒VP60蛋白的重组猪痘病毒为今后重组猪痘病毒应用于兔传染病的预防打下了基础。