背景和目的随着生活水平的提高,人们对健康的要求有了和以往不同的内容,除了生存时间,还期待更高的生活质量。在这种现状下,听力损失对人类健康的威胁得到了高度重视。药物、衰老是引起听力损失的主要原因。在我国,氨基糖甙类药物导致的听力损失位居各种致聋因素之首,作为引起感音神经性聋的主要原因,学者们从形态、蛋白质表达、基因调控、电生理记录等各个方面对其耳毒性机理进行了大量研究,但研究主要集中在耳蜗的内、外毛细胞、血管纹、螺旋神经元部位。内毛细胞带状突触(ribbon synapse),是将声音信息传递给中枢神经系统的第一个传入神经突触,它在氨基糖甙类药物引起的听力损失过程中发挥的作用并没有得到关注。耳蜗作为哺乳动物的听觉器官,能够编码不同频率和强度的声音。耳蜗的外毛细胞对声音频率的有高度敏感性和选择性,对声音有放大作用;内毛细胞是负责将声音信息传递给中枢神经系统的感受细胞。内毛细胞将声波的振动模拟为电信号,在内毛细胞形成电势差,从而刺激神经递质由内毛细胞带状突触释放到相应的螺旋神经元,再由螺旋神经元投射到中枢神经系统。听力损伤常常认为与内、外毛细胞的损伤和/或螺旋神经元细胞的变性相关。连接螺旋神经元和内毛细胞的带状突触作为内毛细胞和螺旋神经元细胞之间的纽带,是影响声音信号传递的重要原因,却一直没有得到充份重视。大量的研究证实,突触传递的效能不是固定不变的。在突触前神经元兴奋,通过神经递质的释放,引起突触后电位的变化,从而完成电信号的传递过程中,突触本身的功能和形态都可能发生改变。这种变化既可以是突触传递效能的增强,也可以是突触传递效能的减弱;既可以是短时程的(数秒到数分钟);也可以是长时程的(数小时到数周)。突触传递效能的各种变化统称为突触可塑性。由于声音信息通过听神经的动作电位传递入脑,所以带状突触结构的重新排列和/或变性会对声音编码产生重要的影响。在耳蜗的某一位置内毛细胞和传入神经之间信号传递的破坏会影响这一位置所对应的语言信号的理解。基于上述考虑,在药物性耳聋的小鼠中,内毛细胞带状突触的形态和功能都将发生改变。由于内毛细胞带状突触所在的位置深在、数量极少,一直以来,对它的研究进展缓慢,在国内尚未见对内毛细胞带状突触进行系统研究的报道。近年来随着研究技术和实验条件的发展,国外的研究者对内毛细胞带状突触正常生理条件下的形态、分子解剖、电生理等方面的研究取得了一定进展,使我们得以对病理状态下的内毛细胞带状突触的结构和功能进行研究。通过电子显微镜观察,典型的耳蜗内毛细胞的带状突触为球形或椭球形的电子密度体。周围附着单层突触囊泡。随着听力水平的不同,带状突触的数量和形态也出现变化。例如,小鼠的每个内毛细胞有16.8±2.4个带状突触,而在听阈增加之后,带状突触的数量减少并且体积增大。对毛细胞电镜超薄连续切片的重构可以得出带状突触的准确数量。这些对动物正常生理情况下内毛细胞带状突触形态的研究方法和研究结果为病理条件下的进一步研究打下了良好的基础。本研究使用庆大霉素腹腔注射制作小鼠感音神经性聋模型,研究感音神经性聋发展过程早期的内毛细胞带状突触可塑性变化:分别对内毛细胞带状突触的数量和功能加以研究。使用免疫荧光双标对突触前结构蛋白RIBEYE及突触后膜受体蛋白GluR2-3进行标记,结合激光共聚焦显微镜、3d max 8.0软件三维重建对内毛细胞带状突触进行数量分析。使用免疫荧光标记及Western blotting对otoferlin蛋白质进行半定量分析,由于otoferlin在内毛细胞带状突触神经递质的胞吐过程中发挥着重要作用。对otoferlin蛋白质表达变化的研究能够体现在庆大霉素作用早期带状突触功能的变化。对药物性耳聋时内毛细胞带状突触数量和功能变化的研究,为其它原因引起的感音神经性聋致病机理的进一步研究打下良好的基础,例如老年性耳聋、噪声性耳聋时内毛细胞带状突触结构和功能的变化。可以进一步利用电镜对内毛细胞带状突触微观结构的变化加以研究,也可使用电生理方法对带状突触的功能进行深入研究。总之,对内毛细胞带状突触的可塑性进行研究,是对感音神经性聋致病机理的新的补充,具有广泛的研究前景和应用前景。材料和方法本实验选用C57小鼠120只(由中国医科大学动物实验中心提供),除外耳和中耳疾病,2月龄,体重25±1.23 g。使用ABRs进行听力评估,造模前听力正常,造模后听阈大于30dB。将小鼠随机分为2部分。每部分分为6组,每组10只,对其中的5组使用100mg/kg庆大霉素进行腹腔注射,分别注射4d(4d组)、7d(7d组)、10d(10d组)、14d(14d组)、21d(21d组),另1组为正常对照组(0d组)。分离小鼠耳蜗基底膜,一部分对耳蜗基底膜进行免疫荧光双标记,使用激光共聚焦显微镜对基底膜进行序列扫描,并对所采得的序列扫描图像利用3ds max 8进行三维重建,进而分析内毛细胞带状突触的数量;另一部分使用免疫荧光方法检测内毛细胞带状突触囊泡中otoferlin的表达,采用westernblotting对otoferlin的表达进行半定量分析。结果一、对正常组耳蜗基底膜顶回的10个序列扫描中的内毛细胞带状突触进行三维建模并计数,得出每个内毛细胞的带状突触数量为(?)±SD=16.10±1.032。二、使用3d max 8.0软件对各组中内毛细胞带状突触数量进行分析,每组中每个内毛细胞所含的带状突触数量的数量以(?)±SD表示,带状突触在庆大霉素腹腔注射第7d时数量最多,6组中每个内毛细胞包含的带状突触数量差异存在统计学意义(P＜0.01)。7d组中每个内毛细胞包含的带状突触数量显著多于其它5组。三、使用免疫荧光方法,FITC标记的otoferlin呈绿色,位于内毛细胞底部,外毛细胞仅有纤毛非特异性着色。利用Western blotting检测otoferlin的表达:在140.5kD左右的位置检测到otoferlin的表达,并对其进行半定量分析。注射庆大霉素前otoferlin表达量较少,在注射第4d时表达量增加,第7d时表达量最多。各时间点otoferlin蛋白表达吸光度比值组间差异显著(P＜0.01)。结论一、在耳蜗基底膜铺片中,由于带状突触并非存在于同一平面,为了对内毛细胞带状突触进行数量分析,使用免疫荧光双标对突触结构蛋白及突触后的受体蛋白进行标记,结合激光共聚焦显微镜序列扫描,最后使用3d max 8.0进行三维重建,可以得到内毛细胞带状突触的准确数量。二、在庆大霉素作用早期,内毛细胞的数量未发生改变时,内毛细胞带状突触的数量已经发生变化。在庆大霉素腹腔注射的第7d,内毛细胞带状突触的数量达到高峰,之后又出现减少。内毛细胞带状突触通过数量的改变,增加或减少与螺旋神经元之间的神经连接。对庆大霉素的耳毒性起到一定代偿作用,但这一作用不足以维持正常听阈。三、在庆大霉素作用早期,内毛细胞的数量未发生改变时,内毛细胞带状突触中otoferlin的表达已经发生变化。在庆大霉素腹腔注射的第4d,内毛细胞带状突触中otoferlin的表达增加,于第7d达到高峰,之后表达下降。提示这种变化可能是带状突触通过otoferlin表达的增强,增加了内毛细胞带状突触的囊泡融合和突触递质的释放,在早期对庆大霉素的耳毒性起到了一定的代偿作用。之后otoferlin表达下降,考虑由于庆大霉素的耳毒性作用影响细胞新陈代谢,使带状突触不能维持原有的形态和功能,导致otoferlin表达减少。