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低温是严重影响水稻生长发育,并造成水稻减产的非生物胁迫之一,了解水稻应答低温胁迫的分子机制,研究与水稻抗低温应答相关的基因的功能,并利用分子生物学的方法来改善水稻耐受的遗传特征,是提高水稻产量的有效途径之一。本实验室前期利用Gateway技术构建了水稻根干旱及盐胁迫的c DNA文库[1],并在其中发现了一个新的孤儿基因,将其命名为Os CPY。在本课题中,我们对Os CPY基因的编码序列,启动子进行了生物信息学分析;利用q RT-PCR分析了逆境胁迫下,Os CPY表达量的变化;构建了Os CPY基因的干扰载体,农杆菌介导法转化水稻,获得了Os CPY基因下调表达转基因植株;观察和分析了低温胁迫下,Os CPY过表达及抑制转基因植株表型变化,主要研究结果如下:1.Os CPY基因的生物信息学分析使用在线网址phytozome的水稻基因组数据库对OsCPY基因进行生物信息学分析,结果显示,Os CPY位于第9号染色体上,仅含有两个外显子和一个内含子。根据Plant CARE在线工具分析Os CPY启动子的顺式作用元件,结果显示该基因的启动子有4个非生物胁迫相关的作用元件:1个热胁迫相关的元件HSE,1个GA胁迫相关的元件TATC-box,2个ABA胁迫相关的元件ABRE、motif IIb。此外,Os CPY启动子中还有1个与胚乳表达相关的顺式作用元件Skn-1-motif。2.Os CPY基因在水稻不同组织中的表达分析为了了解Os CPY基因的时空表达模式,我们利用荧光定量PCR技术分析了正常生长条件下,Os CPY在水稻不同组织中的表达情况。结果表明,正常生长条件下,Os CPY基因在水稻的根、茎、叶及不同开花时期的胚乳中均有表达,且在叶片中的表达量最高,其表达量分别为根的3.38倍,茎的4.38倍。在幼穗扬花的前十天,随着扬花时间的延长,Os CPY基因的表达量呈下降趋势,第10天,其表达量降为第3天的21%。3.Os CPY基因在逆境胁迫下的表达分析我们对三叶期的水稻中花11分别进行低温(8℃)、高盐(200m M Na Cl)、干旱(去水)逆境胁迫处理,分别提取了根、茎、叶的RNA并反转成c DNA,分析了Os CPY在各材料中的表达。结果显示,与正常生长条件相比,低温胁迫下,Os CPY基因在水稻根、茎、叶中的表达量均出现了极显著性上调表达,其表达量分别提高了5.80、4.29、5.07倍。高盐胁迫下,Os CPY基因在茎中的表达量提高了3.89倍,在根中的表达量提高了2.44倍,均存在显著性上调表达。干旱胁迫下,Os CPY基因在茎中存在极显著性上调表达,其表达量提高了4.60倍;在根中存在显著性上调表达,其表达量提高了2.47倍。4.Os CPY基因干扰载体的构建及水稻转化为了研究Os CPY表达量下调对水稻的影响,我们利用PYL-RNAi质粒构建了Os CPY基因的干扰载体,命名为CPY-RNAi。实验室前期构建了Os CPY基因的过表达载体(CPY-OE)和功能互补载体(CPY-FC),利用农杆菌介导法将各转基因载体转化水稻中花11,获得T0代CPY-RNAi转基因水稻植株30株,CPY-OE转基因水稻植株27株,CPY-FC转基因水稻植株35株。利用荧光定量PCR技术分析了Os CPY各转基因植株中的表达量,鉴定获得Os CPY表达量下调和上调转基因T2代纯合植株各3个株系。与野生型相比,表达量下调的干扰植株(RNAi-14,RNAi-74,RNAi-36)中Os CPY表达量分别为中花11的16%,30%,35%。Os CPY过表达植株(OE-24,OE-27,OE-14)中,该基因的表达量分别为中花11的3.75、3.38、2.41倍;功能互补植株(FC-35、FC-13、FC-15)中,该基因的表达量分别提高了3.82、2.23、2.10倍。5.Os CPY转基因植株低温胁迫下生长发育表型观察为了了解Os CPY基因在水稻耐低温中的作用,我们对Os CPY各转基因纯合株系及Os CPY基因突变体(cpy)进行了低温处理,观察并分析了各转基因株系与野生型对照的生长差异。结果表明,8℃低温胁迫5天后,野生型对照叶片出现卷缩现象,叶片暗淡,cpy叶片依然是伸展状态且颜色翠绿;恢复正常温度后,cpy长势较野生型明显更好,且cpy存活率较野生型提高了1.47倍。对野生型及各转基因植株进行8℃低温胁迫,发现野生型植株叶片出现卷缩现象,叶片暗淡,CPY-RNAi植株叶片伸展颜色翠绿,长势较好,CPY-FC植株叶片出现轻微卷缩现象,CPY-OE植株叶片卷缩较为严重;恢复正常温度后,CPY-RNAi植株能够继续生长,CPY-FC植株有新叶展开,但长势较弱,CPY-OE植株叶片枯萎甚至死亡。根据以上实验结果我们推测,Os CPY基因对水稻低温耐受能力具有负调控作用。6.ABA与GA介导下突变体与野生型水稻种子的萌发率检测15℃低温胁迫下,用1μM、10μM、100μM的脱落酸(ABA)处理种子,结果显示突变体cpy与野生型种子的萌发率没有显著性差异。1μM、10μM、100μM的赤霉素(GA)处理后,突变体cpy种子的萌发率较野生型水稻分别提高了18.62%、9.89%、9.05%,两者之间的萌发率存在显著性差异,说明Os CPY基因可能会抑制GA在种子萌发过程中的作用。