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CD82蛋白是抑癌基因KAI1编码的细胞膜糖蛋白,属于四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily TM4SF)成员之一,其主要生物学功能是参与细胞的聚集、粘附、迁移以及调控。CD82在正常机体组织广泛表达,在肿瘤组织表达下降或不表达。大量研究结果表明,CD82可抑制多种组织来源的肿瘤细胞体外迁移和体内转移,被认为是广谱的肿瘤转移抑制因子。对其作用机制的研究日益受到重视。CD82由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。胞外区形成一个小环(small extracellular loop,SEL)和一个大环(large extracellular loop,LEL);跨膜区为四个疏水的肽段;胞内区包括N-端、C-端和一个细胞内环。对CD82蛋白不同结构域的作用进行研究,对阐明其抑制肿瘤转移的分子机理具有十分重要的理论意义。目前,对CD82胞外区大环结构的功能研究较多,对CD82胞外区小环结构功能的研究很少,其功能尚不明确。为弄清楚CD82胞外小环结构域在CD82抑制肿瘤转移中的作用,本论文采用化学方法合成CD82-SEL氨基酸序列模拟肽(CD82-SEL-P),对其在细胞迁移、生长及凋亡中的作用进行了研究。1.CD82-SEL-P对贴壁生长、体外迁移运动等的影响。采用划痕法、Boyden小室培养法,观察了CD82-SEL-P对不同组织来源的肿瘤细胞贴壁生长、体外迁移运动等的影响。实验结果:(1)发现CD82-SEL-P可显著抑制各种贴壁生长的肿瘤细胞的迁移运动,其抑制作用与处理浓度呈正相关。(2)发现CD82-SEL-P可显著抑制细胞的贴壁,转而聚团悬浮生长,其抑制细胞贴壁能力与处理浓度呈正相关。(3)发现CD82-SEL-P促进悬浮生长的细胞聚团生长。结论:CD82-SEL-P能抑制体外培养的贴壁细胞迁移运动;抑制贴壁生长细胞的贴壁,转而聚团悬浮生长;促进悬浮生长的细胞聚团生长。且抑制作用均与处理浓度呈正相关。说明CD82-SEL可能是CD82与肿瘤转移抑制有关的重要结构域,并且独立的CD82-SEL就有肿瘤转移抑制的功能。这一结论尚属首次报道。2.CD82-SEL-P对肿瘤细胞生长、增殖的影响。采用细胞荧光组化及MTT法检测了CD82-SEL-P对不同肿瘤细胞生长及形态的影响。实验结果:(1)CD82-SEL-P可使培养肿瘤细胞收缩、胞浆出现颗粒、空泡,细胞与培养板剥离脱落。(2)CD82-SEL-P可以抑制各种贴壁培养肿瘤细胞的生长、增殖,其抑制作用呈浓度依赖性。(3)CD82-SEL-P促进悬浮生长细胞的生长、增殖。结论:CD82-SEL-P对贴壁生长细胞和悬浮生长的细胞作用相反。CD82-SEL-P抑制体外培养的贴壁细胞的生长增殖,促进悬浮生长细胞的生长增殖。3.以生物素标记的CD82-SEL-P做探针,采用Western blot等技术分别检测了CD82-SEL-P可能结合的膜蛋白和膜脂,以确定与CD82-SEL-P结合的靶分子。实验结果:(1)Western blot结果显示,生物素标记的CD82-SEL-P探针可识别结合的蛋白有数十条之多且均为膜蛋白。(2)生物素标记的CD82-SEL-P可结合到细胞总脂包被的硅胶小球,说明CD82-SEL-P识别结合的靶分子有脂类成份。结论:CD82-SEL-P识别结合的特异结构是寡糖链,其靶分子不是某个特异的蛋白或脂类分子,而是多个分子;包括糖蛋白和糖脂。4.CD82-SEL-P诱导SW620和MDA-MB-231肿瘤细胞凋亡以及机制研究。观察了CD82-SEL-P对SW620和MDA-MB-231肿瘤细胞凋亡的影响,并对其机制进行了初步探讨。实验结果:(1)细胞组化结果显示,CD82-SEL-P可诱导SW620和MDA-MB-231肿瘤细胞凋亡。(2)Western Blot分析结果显示,CD82-SEL-P处理可增加SW620和MDA-MB-231肿瘤细胞Caspase3和Caspase8的表达。(3)CD82-SEL-P诱导SW620细胞凋亡同时发生线粒体膜电位的下降,提示CD82-SEL-P诱导SW620细胞凋亡可能牵涉到线粒体凋亡途径。(4)CD82-SEL-P诱导MDA-MB-231细胞凋亡同时有Caspase12和GRP78表达增高,提示CD82-SEL-P诱导MDA-MB-231细胞凋亡可能牵涉到内质网凋亡途径。结论:(1)CD82-SEL-P可诱导SW620和MDA-MB-231细胞的凋亡。(2)CD82-SEL-P诱导不同肿瘤凋亡通过不同的凋亡途径。CD82-SEL-P诱导SW620细胞凋亡主要通过线粒体凋亡通路,而对MDA-MB-231细胞主要通过内质网凋亡通路。