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天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase,AS)作为初级氮素同化过程关键酶之一,其产物天冬酰胺是植物氮素运输的主要载体。本研究通过对过表达PnAS1的84K杨(Populus alba×Populus glandulosa)转基因植株,采用qRT-PCR筛选出2个在地上部分及根组织中均高表达的试验材料。不同供氮水平下,测定了过表达PnAS1 84K杨植株及野生型WT的生长指标及氮代谢相关的生理生化指标。构建AS1基因的RNAi植物抑制表达载体并获得了抑制表达AS1基因的84K杨转基因株系。此外,通过对杨树基因组的搜索,鉴定出与天冬氨酸代谢密切相关的9个天冬氨酸转氨酶(其催化产物天冬氨酸,是天冬酰胺合成的唯一受体)家族基因并对其进行生物信息学简要分析,主要研究结果如下:(1)从杨树基因组中鉴定了 9个天冬氨酸转氨酶家族基因(PtASPAT),其中7个真核型 ASPAT基因(PtASPAT1～PtSPAT7)及 2 个原核型 ASPAT基因(PtASPAT8～PtASPAT9)。采用实时荧光定量PCR技术对9个PtASPAT家族基因表达水平检测。结果显示PtASPAT在根中的表达要高于其它部位(叶和茎);PtASPAT1在根茎叶中表达量基本一致;PtASPAT4在根中表达量显著,推测PtASPAT4及PtASPAT8可能在杨树根中初级氮素同化过程中起到重要作用。(2)对获得的高表达转基因株系(OEAS1-11及OEAS1-12株系),进行了三种供氮水平(NH4N03浓度分别为0.05 mmol、1 mmol及5 mmol)处理,测定生长指标株高、地径及叶面积;氮代谢相关的生理生化指标GOT酶活、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量及植物总氮总碳含量。结果表明:低氮条件下(0.05 mmol NH4N03)过表达植株的叶片颜色更深更绿且叶片总数也有所增加,其中OEAS1-12尤其明显。1 mmol及5 mmol NH4N03处理条件下OEAS1-11及OEAS1-12的叶面积均高于WT。但三种氮素处理条件下OEAS1-11及OEAS1-12的株高、地径与野生型WT相比无显著差异。氮代谢相关生理指标测定结果表明:0.05 mmol NH4N03处理下,与野生型WT相比,OEAS1-11株系具有更高的N含量,更低的C/N比,但总C含量差异不显著;与OEAS1-11株系不同的是,OEAS1-12株系表现出更高C/N比。OEAS1-11及OEAS1-12株系GOT酶活均高于WT,其中地上部分GOT酶活是WT的在4～5倍之间;根中则是2～3之间,差异显著;OEAS1-11地上部分可溶性糖含量显著低于WT,但在根中则显著高于WT;OEAS1-12可溶性糖含量与WT相比无显著差异;OEAS1-11和OEAS1-12地上部分可溶性蛋白均显著高于野生型WT;1 mmol NH4N03 及 5mmol NH4N03 处理条件下,OEAS1-11 及 OEAS1-12 在根中可溶性糖含量OEAS1-11及OEAS1-12均高于WT,差异显著;在1 mmol NH4N03处理条件下地上部分GOT酶活OEAS1-12株系显著高于WT;根中GOT酶活OEAS1-11株系显著高于WT;地上部分可溶性蛋白的含量OEAS1-11显著高于WT;根中可溶性蛋白含量OEAS1-11、OEAS1-12均显著高于WT;过表达AS基因植株,改变了自身植物体CN平衡,其中0.05 mmol NH4N03处理下最为明显,实验结果有待进一步研究。(3)天冬酰胺代谢相关的基因的表达:对天冬酰胺合成相关的基因ASPAT、AsnAT、ASPG、GS、GOGAT半定量检测结果显示:转AS基因的过表达植株增强了ASPAT4、ASPAT8、ASPG1 ASPG2、ASPG4及GS2基因表达水平。低氮水平天冬氨酸转氨酶GOT酶活,可能是由于ASPAT4和ASPAT8的表达量升高导致的;此外GS2的升高,说明潜在的促进谷氨酰胺的合成;谷氨酰胺作为天冬酰胺合成的酰胺供体,谷氨酰胺增多会促进天冬酰胺合成。天冬酰胺酶基因ASPG1、ASPG2、ASPG4升高,可能会促进天冬酰胺水解成天冬氨酸。(4)构建了 AS1基因RNAi表达载体。转化84K杨后获得了 15个AS1基因的抗性株系,并对其中6个株系进行PCR及荧光定量PCR检测。确定外源DNA已经整合到84K杨树基因组中。5个转化子的AS1基因的表达量均不同程度降低,其中IEAS1-2、IEAS1-3植株的抑制效果最为显著。氮代谢相关生理指标测定结果表明:在0.05 mmol NH4N03处理下IEAS1-2和IEAS1-3可溶性蛋白的含量均低于野生型WT,其中IEAS1-3差异显著;地上部分可溶性糖含量IEAS1-2和IEAS1-3均低于WT,其中IEAS1-2显著低于WT;根中GOT酶活均IEAS1-2和IEAS1-3株系显著低于WT,地上部分GOT酶活无显著差异;1 mmol NH4N03和5 mmol NH4N03处理中,地上部分可溶性蛋白的含量与WT相比,IEAS1-2和IEAS1-3无显著差异,根中可溶性蛋白含量IEAS1-2和IEAS1-3显著低于WT。在1mmol NH4N03处理条件下,地上部分和根中可溶性糖IEAS1-2和IEAS1-3均低于WT,差异不显著;GOT酶活均低于WT,差异显著;5mmol NH4N03处理条件下,根中可溶性糖IEAS1-2和IEAS1-3均低于WT,地上部分可溶性糖无显著差异。对天冬酰胺合成相关的基因ASPAT、AsnAT、ASPG GS、GOGAT半定量检测结果表明:抑制表达转基因植株IEAS1-2和IEAS1-3增强了ASPAT1的表达,ASPG4表达水平降低,ASPG1及ASPG2表达量有所降低,推测可能会抑制天冬酰胺水解成天冬氨酸。