论文部分内容阅读
目的研究成人脂肪基质干细胞体外诱导分化为神经元过程中Bcl-2/Bax调控蛋白与线粒体凋亡通路的关系,从而为进一步增加获得的ADSCs源性神经元数量并延长其存活时间提供科学的指导方法。方法1参照叶长青等的实验方法,将所取的成人脂肪组织体外分离、培养为ADSCs,倒置相差显微镜下每日观察ADSCs的形态学变化。2将传至第2、3代的生长状态良好的ADSCs,应用以含β-巯基乙醇为主要成分的诱导剂诱导其向神经元分化,按照诱导时间长短的不同将细胞分为未诱导组、预诱导组及诱导1h、3h、5h、8h组,并在倒置相差显微镜下观察诱导分化后的细胞形态学变化。3应用免疫细胞化学法和Western-blotting法分别检测未诱导的ADSCs及预诱导组、诱导分化1h、3h、5h、8h组的神经元特异性烯醇化酶(Neurons specific enolase,NSE),Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax,半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9(Cysteine aspartate specific protease-9,Caspase-9),细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-c)及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cysteine aspartate specific protease-3,Caspase-3)的表达情况。4透射电子显微镜下观察诱导反应过程中细胞和线粒体超微结构变化的特点。5应用激光共聚焦显微镜测定线粒体的荧光强度来反应线粒体膜电位值及其通透性。6应用流式细胞术Annexin/PI双染法检测未诱导的ADSCs及预诱导、诱导分化1h、3h、5h、8h时细胞的生存状态。7统计学方法:所得实验数据应用Excel 2003数据库整理,所得数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析,数据均以均数±标准差(sx±)表示,采用单因素方差分析对不同时间点间的数据进行比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果由成人皮下脂肪组织中分离提取的ADSCs于24h时已经完全贴壁生长,倒置相差显微镜下可见细胞形态多样,可呈长梭形、短梭形、类圆形或不规则形。生长至10天左右,可见大量长梭形细胞呈旋窝状生长。2在预诱导组,细胞开始发生分化,伸出短小的突起。诱导反应1h时,细胞胞核变大变圆,胞质回缩,胞体周围可见伸出长突起,类似神经元轴突样结构。诱导3h时,细胞胞质折光性增强,细胞外可见明显光晕,胞体周围突起进一步伸长,交织成网状。诱导至5h时,细胞折光性进一步增强,细胞突起末端出现分支,类似于树突细胞,细胞形态呈典型神经元样形态。诱导至8h时,部分细胞胞体回缩,胞体周围突起变短,并且死亡细胞数量较5h组明显增多。3免疫细胞化学法在未诱导组ADSCs未检测到NSE的阳性表达,在预诱导组及诱导第1h、3h、5h、8h组均可见NSE的阳性表达,在诱导第5h时NSE的阳性表达率(83.60±3.20%)进入高峰期(P<0.05),诱导第8h时NSE的表达与5h时无明显差异(P>0.05)。随着诱导反应时间延长,Bcl-2的表达水平明显逐渐降低,且以未诱导组最高(P<0.05);而Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表达水平则明显逐渐升高,诱导至8h时达到高峰值(P<0.05)。4应用Western-blotting法在未诱导组ADSCs检测到NSE的弱阳性表达,在预诱导组及诱导第1h、3h、5h、8h组均可见NSE的阳性表达,在诱导第5h时NSE的表达水平已经进入高峰期(P<0.05),诱导第8h时NSE的表达与5h时无明显差异(P>0.05)。随着诱导反应时间的延长,Bcl-2的表达水平明显逐渐降低,且未诱导组最高(P<0.05);而Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表达水平均逐渐升高,诱导至8h时达到高峰(P<0.05)。5透射电子显微镜下观察到诱导5h时的凋亡细胞具有细胞核固缩、染色质边集和线粒体肿胀、空泡化等超微结构变化特征。6激光共聚焦显微镜的检测结果显示,随着诱导时间的延长,线粒体荧光强度逐渐减弱(P<0.05)。7流式细胞术的检测结果显示,诱导反应过程中的细胞存活率随着诱导时间的延长逐渐下降,早期凋亡率、晚期凋亡或坏死率随着诱导时间的延长而逐渐升高。结论在ADSCs体外诱导分化为神经元的过程中,反应至第5h时ADSCs已经分化成了典型的神经元样细胞,而且在诱导反应第5h以前的分化细胞具有较强的Bcl-2抗凋亡能力,而Bax的促凋亡作用较弱。Bax可以作用于线粒体膜,产生线粒体膜电位和结构改变而使Cyt-c由线粒体释放到细胞浆中,从而引发线粒体介导的Caspase依赖型细胞凋亡反应,而成为这种诱导反应过程中导致细胞死亡的主要原因之一。