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目的 构建人突变p27基因重组腺病毒载体，用以转染大肠癌细胞株SW480，观察人突变p27基因在大肠癌细胞中的表达，对大肠癌的生长抑制作用及促细胞凋亡作用，并对其机制进行探讨。 方法 将pORF9-hp27mt经AgeI和NheI酶切、低熔点琼脂糖电泳回收619bp的目的基因片段，插入到经XmaI和XbaI酶切的pBluescript Ⅱ sk（+）质粒中，发生定向重组，构建中间载体pBluescript-hp27mt；载体pShuttle-CMV和pBluescript-hp27mt经NotI和kpnI酶切后，分别回收7388bp和699bp两个片段，使其定向重组，构建穿棱质粒pShuttle-CMV-hp27mt；用腺病毒骨架质粒pAdeasy-1转化感受态大肠杆菌BJ5183，制备含pAdeasy-1的超感受态BJ5183，然后再用经PmeI酶切的pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183，使其发生定向重组，构建重组腺病毒质粒pAdeasy-1-hp27m，经鉴定正确后，转染Ad293细胞，包装成重组腺病毒Ad-hp27mt，PCR进行鉴定。重组腺病毒Ad-27mt转染SW480细胞，Western blot检测p27在细胞内的表达；用细胞计数法观察突变p27对大肠癌的生长抑制作用；用流式细胞仪观察细胞周期的分布及凋亡峰；用DNA片段分析法及TUNEL法检测细胞的凋亡。 结果 （1） 线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183，12-20h后，获得30％阳性重组质粒克隆，经酶切获得一大于20kb的大片段和一3.0kb的特征性小片段，PCR扩增出了275bp的片断，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp27mt。（2） 重组腺病毒质粒转染Ad293细胞，第14d细胞出现病变、扩增后，经CsCl密度梯度离心获得7.95×1015pfu／L的高滴度腺病毒，经PCR鉴定正确。（3） 用Ad-LacZ检测腺病毒对大肠癌细胞的转导效率，当感染复数MOI≥50时，可获100％转导。（4） Ad-hp27mt转染大肠癌细胞SW480后24h，Western blot法检测到p27在细胞内获得了高表达。（5） 流式细胞仪检测发现p27mt能有效阻滞细胞于G0／G1期，Ad-p27mt组G0／G1期细胞占77.9％，且Ad-p27mt组出现了明显的亚二倍体峰，而Ad-LacZ组和对照组的G0／G1期细胞分别为27.6％和25.3％。（6） DNA片段分析发现，Ad-p27mt组出现了180～200bp的特征性凋亡梯带。（7） TUNEL检测，Ad-p27mt组，凋亡指数达82.6%，而正常对照组为5.0%。（8）通过细胞计数法检测Ad一p27mt对细胞的生长抑制发现，Ad一p27mt转染的细胞在24h内即出现了生长抑制，并持续了7d。 结论（l）细菌内同源重组可高效、简便、快捷制备重组腺病毒质粒。（2）腺病毒作为一种基因转移载体，可有效介导p27mt在肿瘤细胞中的表达，在肿瘤的基因治疗方面具有应用前景。（3） p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，且对细胞生长具有明显的抑制作用。（4） p27mt对大肠癌细胞具有促凋亡作用。（5） p27mt为p27治疗大肠癌提供了高效的基因形式，具有重要意义。