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目的:复制8J/cm2UVA诱导的HaCaT细胞凋亡模型,建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型,从热休克转录因子1(HSF1)/热休克蛋白70(HSP70)/活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、c-Jun氨基术端激酶(JNK)角度,研究扇贝多肽(Polypeptide fromChlamys farreri,PCF)抑制UVA引起的HaCaT细胞凋亡的分子机制。
方法:复制8J/cm2UVA诱导HaCaT细胞凋亡模型。利用阳离子脂质体(LipefectimeTM2000)法建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型。实验设计为:对照组、UVA模型组、UVA+iNOS特异性抑制剂1 mmol/L SMT组、UVA+ROS清除剂0.5 mmol/L NAC(N-acetyl-L-cysteine,NAC)组、UVA+HSP70转录活性抑制剂50μmol/L槲皮素组、UVA+黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂100μmol/L别嘌呤醇(Oxy)组、UVA+5.69 mmol·L-1PCF组、UVA+2.84 mmol·L-1PCF组、UVA+1.42 mmol·L-1PCF组。Honechst33258荧光染色观察细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测磷酸化HSF1(p-HSF1)、HSP70、iNOS在UVA辐射损伤HaCaT细胞后于细胞内的经时(1、3、6、12、18、24 h)变化及6 h后JNK、磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表达量;Real-Time PCR检测HSF1 mRNA、HSP70 mRNA、XO mRNA的表达;以电子自旋共振法(ESR)同时检测UVA照射后细胞内NO与ROS的经时变化及Oxy、SMT、PCF对NO释放量的影响。
结果:Honechst33258荧光染色证实成功复制8J/cm2UVA损伤HaCaT细胞后18 h的凋亡模型,1.42～5.69 mmol/L剂量范围内的PCF与1 mmol/LSMT、0.5 mmol/L NAC均能够明显抑制UVA引起的HaCaT细胞凋亡(P＜0.05);蛋白经时变化显示P-HSF1于8J/cm2UVA照射后3 h达高峰(P＜0.05)而HSP70表达高峰出现于6 h(P＜0.05);UVA辐射前预先加入槲皮素使p-JNK、iNOS、XO的表达量升高,NO、ROS释放量增加且细胞凋亡率增加(P＜0.05);1.42～5.69 mmol·L-1剂量范围内的PCF可剂量依赖性抑制提高HSF1的转录活性、增加HSP70蛋白和HSP70 mRNA的表达、抑制ROS和NO的生成、降低JNK的活化(P＜0.05,P＜0.01);UVA照射HaCaT细胞后NO于3 h、18 h产生两个表达高峰。
结论: PCF可抑制8J/cm2UVA诱导的HaCaT细胞凋亡,其作用机理是能够提高HSF1转录活性使HSP70表达增多从而作为自由基清除剂抑制ROS、NO的生成并降低JNK的活化有关;UVA照射HaCaT细胞后NO与ROS均产生两个表达高峰,NO第一个高峰由XO催化产生,第二个高峰则与iNOS有关。