研究背景：腹泻病是导致全球儿童发病和死亡的主要病因之一,在低收入国家每年约有2百万儿童因腹泻而死亡。引起感染性腹泻的病原体主要为细菌、病毒和寄生虫等,随着抗生素的应用和生活卫生条件的改善,细菌性腹泻得到了有效控制,病毒已成为引起腹泻的最常见原因,也越来越受到人们的重视。病毒多具有传染力强、传播快、发病急及病后免疫力不能持久等特点,常可导致较高的发病率,造成疾病的大流行甚至死亡引起婴幼儿腹泻的病毒主要包括人轮状病毒(Human Rotavirus, HRV)、人杯状病毒(Human Calicivirus, HuCV)、腺病毒(Human adenoviruses, AdV)、人类星状病毒(Human astrovirus, AstV); A组轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿重症腹泻的最常见病原,是目前病毒性腹泻预防控制的重点；人杯状病毒其感染率仅次于轮状病毒,可引起暴发流行,常导致突发性公共卫生事件。此外,腺病毒和星状病毒也能引起腹泻,其重要性也日益突出。但是还有大约40%的婴幼儿腹泻病无法检出相关的病原,所以引起腹泻的其它未知病原(尤其是病毒)也应该引起人们重视。人类博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)是Allander2005年8月对患急性上呼吸道感染的婴幼儿的呼吸道分泌物样木进行大规模筛查时,发现的一种与已知细小病毒类似的新病毒,由于该病毒的基因序列与牛和犬博卡病毒同源性很高,故命名为人类博卡病毒。HBoV虽然与细小病毒B19之间核苷酸序列同源性很低,但是其基因组特性类似于细小病毒B19。之后世界范围内陆续有研究报导在粪便、尿液等标本中均有检出HBoV,2007年Lau SK等首次证实HBoV在我国的存在。HBoV感染一年四季均可发生,以冬春季为主,但不同国家报道的季节特征有所不同。HBoV感染的临床表现主要为轻度的呼吸道症状和消化道症状,主要感染2岁以下儿童,特别是婴幼儿。HBoV在腹泻标本中陆续被检出,检出率从0.8%到12%,因此,有些学者认为HBoV不但是呼吸道疾病的致病原,也有可能是胃肠炎的致病原之一；且有研究发现HBoV是继轮状病毒、诺如病毒之后引起腹泻的第三大病毒。目前国外有不少关于HBoV在急性胃肠炎患者中的病原学及流行病学研究,但是我国却很少开展相关研究,且广州尚缺乏急性胃肠炎患者人博卡病毒的流行病学特征的数据资料。人双埃可病毒(Human parechovirus, HPeV)是属于小RNA病毒科(Picomaviridae)、双埃可病毒属(Pareehovirus)的一种无囊膜、无纤突的单分子正链RNA病毒,基因组包含7300个核苷酸,在5’端到3’端都有一个非翻译区(UTR),有3个结构蛋白(VP1-VP3)和7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D)。.1956年首次在美国从一名腹泻患儿的粪便标本中分离获得,随后世界范围内多种基因型别的HPeV陆续从腹泻粪便标本中分离出来。迄今为止,已经有16种HPeV基因型先后被发现,各国研究结果均提示HPeV在腹泻患者的粪便标本中普遍存在,而且HPeV感染在儿童尤其是幼童中非常普遍。目前国外有不少关于HPeV的病原学及流行病学研究,而国内却很少开展相关研究。仅2009年分别在兰州和上海、2011年在吉林开展过急性腹泻儿童的人双埃可病毒的分子流行病学调查报道,而广州地区尚未见相关报道。HPeV7-16型目前还没有相关的流行病学调查资料,在世界范围内很少检测到这些型别,说明它们的感染率可能低于HPeV1,但也不能排除是新近发现的可能性。HPeV主要在胃肠道繁殖,引起腹泻,经常伴有呼吸道症状,感染在幼童中特别容易流行。HPeV感染后引起的临床症状与感染人肠道病毒后的症状相类似,主要引起胃肠道、呼吸道相对温和的症状,也会引起脑膜炎、脓毒症、心肌炎及弛缓性麻痹等严重症状。另有研究发现HPeV与其他腹泻病毒混合感染的情况,且大部分是与轮状病毒混合感染,因此开展腹泻患儿HPeV感染情况的研究,了解HPeV在广州地区的流行特点具有重要意义。我国婴儿出生率位居世界第二,感染性腹泻作为儿童常见病、多发病应进行长期连续系统的监测。对HRV、NoV、SaV、AdV和AstV常见腹泻病毒进行检测,以了解腹泻病毒的流行情况,为我国病毒性腹泻的预防和控制积累病原学和分子流行病学本地资料。同时对广州哨点医院急性腹泻儿童的HBoV和HPeV进行分子流行病学调查,以了解HBoV和HPeV的流行特点和临床特点,分析其在婴幼儿腹泻中的病原学作用,为其防治提供参考的临床及流行病学资料。研究目的：1.了解广州市哨点医院2012年7月-2013年6月5岁以内腹泻患儿HRV、NoV、 AdV、AstV和SaV的流行病学特点,丰富我国南方病毒性腹泻的相关资料,为我国腹泻感染控制提供分子生物学基础和流行病学背景资料。2.了解广州地区HBoV和HPeV在腹泻患儿的流行情况,掌握广州市HBoV和HPeV流行病学和病原学本底数据,同时了解病毒性腹泻HBoV和HPeV的基因型别,探讨优势毒株,为HBoV和HPeV感染所致腹泻的防治提供基础数据和理论依据研究方法：1.标本收集：以广州市某三甲医院和某社康医院为监测哨点医院,按监测方案要求采集病毒性腹泻病例粪便标本。共收集2012年7月至2013年6月322份5岁以下腹泻门诊患儿的粪便标本,同时收集患儿的人口学资料(包括性别,年龄等),临床表现资料(如腹泻天数、发热、呕吐等)。2.病毒检测：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹泻患儿粪便标本中的A组轮状病毒抗原。对所有粪便标本进行DNA/RNA提取,采用PCR、RT-PCR等方法检测杯状病毒、星状病毒及腺病毒,对阳性标本进行基因测序；采用巢式PCR检测HBoV,并对阳性标本进行测序；通过逆转录—巢式PCR检测HPeV,进而通过基于VP3/VP1区的巢式PCR扩增片段的测序结果进行基因分型。应用BLAST将测序结果在GenBank上寻找同源序列,应用ClustalW进行多序列对比分析和MEGA5.0软件构建遗传进化树,进行基因型别分析,判断流行优势株。3.统计分析：数据管理采用Epidata3.I进行双份录入,运用SPSS13.0软件进行统计分析,检验水准α=0.05。结果：1.2012年7月至2013年6月共收集符合腹泻诊断标准的粪便标本322份,男女性别比为1.30：1(182/140)；就诊者中,年龄最大4.9岁,年龄最小的为0.2月龄,平均年龄28.80±0.72月龄,患儿的性别年龄分布差异无统计学意义(t=0.903,P=0.367)。2.(1)322份腹泻患儿的粪便标本中,126份(39.1%)至少检出五种常见病毒中的一种。按单一病原统计,轮状病毒(21.12%,68/22)是最主要的病原,其后依次为诺如病毒(9.63%,31/322)、腺病毒(7.76%,25/322)、星状病毒(4.35%,14/322)及札幌病毒(1.55%,5/322)。(2)诺如病毒分型结果显示25株属于诺如病毒GⅡ.4基因型,3株属于GⅠ.3型,2株GⅡ.6型,1株属于诺如病毒GⅡ.5基因型；5例札幌病毒感染分别属于SaV GⅠ.1基因型(2例)、GⅠ.2基因型(2例)和GⅡ.2基因型(1例)。14例星状病毒感染中,全部为血清型1(AstV1)。25例腺病毒感染以肠道腺病毒AdV41(80%,20/25)为主要流行株,其余为非肠道腺病毒AdV7(16%,4/25)和AdV5(4%,1/25)。(3)五种病毒检出者主要集中在2岁以内婴幼儿。轮状病毒以9月至次年1月为发病高峰；诺如病毒全年可见散发,但在2012年7月和2013年3月的检出率较高,札幌病毒分别在9-10月和次年3-4月份检出；星状病毒感染在6-9月份有明显的流行高峰；腺病毒感染呈全年发病,以2013年8月检出率最高。(4)混合感染占4.97%(16/322),以轮状病毒(75%,12/16)混合感染为主。15例为两种病毒混合感染,1例为HRV/SaV/AdV三重感染,检出最高的是轮状病毒和腺病毒混合感染5例(31.3%,5/16)；把混合感染与轮状病毒单独感染病例的临床症状做比较,发现混合感染并没有加重患儿的临床症状。3.2012年7月至2013年6月,322份腹泻患儿粪便标本中,检测出人博卡病毒阳性标本31份,阳性率9.63%。感染主要发生在10-1月份,不同月份之间存在差异,具有统计学意义。患儿主要分布于2岁以下(96.8%,30/31)。以HBoV1(54.8%,17/31)和HBoV2(45.2%,14/31)为主要流行株,未检出HBoV3和]HBoV4。 HBoV与其它常见病毒的混合感染率为45.2%(14/31),尤其是与轮状病毒的混合感染,有9例与轮状病毒混合感染,占71.4%。HRV与HBoV混合感染后并没有加重患儿的临床症状。4.(1)2012年7月至2013年6月,在322份腹泻患儿粪便标本中检出42例HPeV,检出率为13.04%,HPeV感染存在两个流行的高峰,分别为7月份(28.2%,11/39)和8月份(28.6%,8/28)。4-12月龄患儿阳性率最高,明显高于其他年龄段,差异有统计学意义(x2=14.134,P=0.015)。小于2岁的患儿占HPeV腹泻患儿人数的97.6%(41/42)。测序结果显示42份阳性标本中69.0%(29/42)是HPeV1(其中HPeV1A占62.1%,18/29; HPeV1B占37.9%,11/29),其后依次为HPeV6(5例)、HPeV3(2例1、HPeV4(2例)、HPeV8(2例)、HPeV5(1例)和HPeV14型(1例)。(2)50.0%(21/42)的HPeV阳性标本同时感染了上述五种常见肠道病毒,其中18例为双重感染,3例为三种病毒共同感染。HRV是混合感染HPeV阳性标本中最常见的病毒(31.0%,13/42)。在HPeV阳性和HPeV阴性的腹泻患儿中,HRV、NoV、AdV、AstV和SaV的检出率差异无统计学意义。比较上述五种病毒单独感染腹泻患儿和HPeV与上述病毒混合感染腹泻患儿的临床症状(呕吐,发热,腹泻次数及病程),差异无统计学意义,表明HPeV感染并不会加重腹泻患儿的临床症状。结论：1.结果表明病毒性病原在婴幼儿腹泻中占重要地位,轮状病毒仍然是婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原,但杯状病毒、腺病毒和星状病毒也是本地区婴幼儿病毒性腹泻的重要病原,且不同病毒引起的季节性高峰有所不同,因此长期连续的疾病监测具有重要意义。2.诺如病毒、札幌病毒、星状病毒和腺病毒的基因型别多样,NoV GII.4型是引起广州哨点医院5岁以内婴幼儿腹泻的流行株；星状病毒的主要流行株是AstV1;腺病毒的为AdV41未检出AdV40；婴幼儿SaV以GI型为主。3.广州哨点医院5岁以下儿童粪便标本中博卡病毒阳性率较高,基因型为HBoV1和HBoV2,人博卡病毒与其它病毒混合感染率较高,尤其多见于和轮状病毒混合感染,但人博卡病毒感染并不影响疾病的严重程度。4.人双埃可病毒感染在广州哨点医院腹泻婴幼儿中普遍存在,检出率仅次于轮状病毒,HPeV1是广州哨点医院2012-2013年的主要流行型别和致病型别,主要是HPeV1A,首次在中国检测出一株人双埃可病毒基因型14(HPeV14)。人双埃可病毒与其它病毒混合感染率较高,尤其是和轮状病毒混合感染；五种病毒单独感染腹泻患儿和HPeV混合感染腹泻患儿的临床症状比较,表明HPeV感染并不会加重腹泻患儿的临床症状。但是HPeV在婴幼儿腹泻粪便标本中的高检出率,应引起人们关注。