乳腺癌是一种女性最为常见的恶性肿瘤,起源于乳腺导管内上皮或乳腺腺泡上皮细胞的恶性癌变,严重危害女性的身体健康。乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势,全球每年新增乳腺癌病例达150万左右,其发病率已占女性恶性肿瘤发病率的首位。在我国,乳腺癌的发病率以每年2%~3%的速度增长,乳腺癌已成为上升幅度最快的恶性肿瘤之一。由于常规的化疗药物对癌细胞与正常细胞的选择性较差,给患者带来了一定的毒副作用。因此研究和开发高效且毒性作用较低的抗癌药物已经成为乳腺癌治疗的重点。许多天然产物具有来源广泛、类型多样、不良反应较小等优点,在抗癌药物的开发方面极具潜力。在我国,铁皮石斛主要产自浙、桂、湘、黔等地区,是天然药用植物,主要具有增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、促消化和抗炎症等药理功能。铁皮石斛中富含芪类化合物,主要包括双苄酚类及菲酚类化合物。有文献报道铁皮石斛的活性成分毛素兰具有潜在抗癌活性和抑制肿瘤内新生血管发生的潜力。然而,铁皮石斛及其活性成分毛兰素对人乳腺癌细胞的作用效果及其机制研究却未见报道。本研究围绕铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对人乳腺癌细胞的增殖、细胞周期调控、细胞凋亡等方面的作用进行了研究,并对其可能的作用机制加以探究,为乳腺癌的治疗提供新的思路和实验依据。为了研究铁皮石斛提取物对人乳腺癌细胞的作用,我们选取一种最常用的人乳腺癌细胞系MCF-7为初步的研究对象,通过MTT实验检测铁皮石斛提取物对该细胞增殖的影响。实验结果表明铁皮石斛提取物对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并呈现浓度依赖和时间依赖的趋势。由于石斛提取物为混合物,含有多种成分,所以我们进一步对其活性成分毛兰素进行了深入研究。我们发现毛兰素对Luminal A型乳腺癌细胞系MCF-7和T47D具有明显抑制作用,其中,毛兰素对T47D的抑制效果最强,并呈现浓度依赖和时间依赖的趋势,而毛兰素对三阴性细胞MDA-MB-231几乎没有抑制作用,证明了铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对Luminal A型乳腺癌细胞系具有明显的抑制效果。我们对铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对乳腺癌细胞的作用机制进行了研究。通常情况下,细胞生长的抑制与细胞周期的阻滞密切相关,因此我们检测了铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对乳腺癌细胞周期的影响。流式细胞仪检测的结果显示,铁皮石斛提取物诱导MCF-7细胞周期阻滞于G2/M期,其活性成分毛兰素同样能够诱导T47D细胞停滞在G2/M期,呈现剂量依赖和时间依赖的关系。这说明铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素能够诱导Luminal A型乳腺癌细胞周期停滞。细胞周期的调控是由大量调控因子参与的复杂过程,我们对其中一些调控因子进行了检测,拟阐述铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素诱导细胞周期停滞的潜在机理。铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素能够下调一些CDK家族成员和GATA3的表达水平,并能上调p53和一些CDKI家族成员的表达水平。细胞周期的调控机制是一个庞大而复杂的网络系统,铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素诱导细胞周期停滞在G2/M期,可能是通过多个因子(包括CDK家族、CDKI家族、p53、GATA3等)参与、多条通路(p53-p21、p27及GATA3-p18等)共同调控完成的。我们发现铁皮石斛提取物能够上调线粒体膜上的凋亡因子Bax,下调Bcl-2的水平,这提示我们其很有可能启动线粒体凋亡途径。因此,我们通过DAPI染色以及Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术等方法进一步检测了铁皮石斛活性成分毛兰素对细胞凋亡的影响。发现毛兰素能够诱导人乳腺癌细胞T47D的早期凋亡和晚期凋亡,并随着毛兰素处理浓度的加大和时间的延长,其诱导细胞凋亡的效果明显增强。在对其凋亡机制的研究中,我们发现毛兰素能够通过上调Bax,下调Bcl-2的表达水平,进而将凋亡信号传递给凋亡起始者caspase-9,激活的caspase-9再激活凋亡执行者caspase-3和7,最后启动线粒体凋亡途径。由于乳腺癌的发生和发展涉及多条信号通路间的相互作用,多种效应因子的参与,因此,我们检测了铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对乳腺癌分子标志物的影响。铁皮石斛提取物能够下调雌激素受体ERα的表达水平,其活性成分毛兰素也能够通过下调ERα的表达使下游ERK信号通路的活化受阻,这可能是其抑制Luminal A型乳腺癌细胞增殖的另一个机制。我们还发现,铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素也能够下调孕激素受体(PGR)和Ki-67细胞增殖核抗原的表达,上调抑癌基因ELF5的表达,说明这些因子也同样参与到铁皮石斛提取物对Luminal A型乳腺癌细胞增殖的抑制作用中。在抑制癌细胞恶性增殖的同时,进一步控制其转移是治疗成功与否的关键,与患者的预后结果密切相关。因此,我们检测了铁皮石斛活性成分毛兰素对细胞迁移的影响。实验结果表明,毛兰素能够抑制T47D细胞的迁移能力,且不依赖于其对细胞增殖的抑制作用。毛兰素能够通过下调ERK1/2的活性,抑制基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的基因表达;也可以通过上调其相对应的抑制剂TIMP2和TIMP1的表达,抑制MMP2和MMP9的酶活性,从而抑制其对细胞外基质的降解作用。同时,毛兰素也可通过上调上皮标志物E-cadherin,下调间质标志物N-cadherin和纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)的表达来抑制细胞的运动能力。衡量一种天然活性物质的抗癌作用,不仅仅需要检测其对癌细胞的抑制能力的大小,同时考察其对正常细胞是否具有毒性作用也是必不可少的环节。我们发现铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素并不抑制正常乳腺上皮细胞MCF10A的增殖,说明其对正常乳腺上皮细胞没有毒性作用,而对于Luminal A型乳腺癌细胞的抑制作用可能是具有选择性的。我们的研究结果表明,铁皮石斛提取物能够抑制Luminal A型乳腺癌细胞的增殖,促使其停滞在G2/M期,其活性成分毛兰素同样能够抑制Luminal A型乳腺癌细胞的增殖,促使其停滞在G2/M期,并能诱导其凋亡,同时也能抑制其迁移的能力。由于铁皮石斛提取物及其活性成分毛兰素对正常乳腺上皮细胞未见毒性作用,说明它们对于Luminal A型乳腺癌细胞的抑制作用可能具有选择性。本研究为铁皮石斛及其活性成分毛兰素在抗乳腺癌药物的开发和应用提供了理论依据。