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癫痫是一种严重的神经系统疾病,给社会、家庭和个人都带来了沉重的负担。我国目前约有900万癫痫患者,其中约25%为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporallobe epilepsy,TLE)是最常见的难治性癫痫,其发病机制目前尚未完全清楚,药物及手术治疗均难以取得明显的疗效。氯化锂.匹罗卡品致痫大鼠行为学、脑电图和海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似,因此是目前研究癫痫持续状态(status epilepticus,SE)和TLE的常用模型。癫痫发作能造成神经元损伤已被广泛认可,但癫痫发作致神经元损伤的分子机制目前仍不十分清楚。鉴于癫痫病因及发病机制的复杂性,探索新的神经保护药物及其潜在的作用机制是目前癫痫研究的热点。Ghrelin是一种新发现的由28个氨基酸组成的脑.肠肽,主要由胃底粘膜分泌。它可以通过其功能性受体GHSR-1α作用于垂体和下丘脑刺激生长激素释放、促进食欲和增加体重。此外,大量的研究证实ghrelin在一些细胞中可以介导抗凋亡作用。近年来对ghrelin神经保护作用的研究也日益深入,如ghrelin可抑制缺氧低糖引起的下丘脑神经元损伤,并且对脑缺血再灌注后的大鼠皮层和海马神经元具有保护作用。研究提示ghrelin可以通过激活PI3K/Akt信号通路及抑制线粒体凋亡通路发挥抗凋亡作用。Ghrelin具有抗凋亡及神经保护作用已被广泛认可,但其是否能在癫痫引起的海马神经元损伤中发挥保护作用目前研究还很少。为此,本课题建立氯化锂.匹罗卡品致痫大鼠模型,探讨癫痫发作后海马神经元损伤的病理学特征;检测匹罗卡品致痫后及腹腔给予外源性ghrelin后大鼠海马信号转导通路及线粒体凋亡通路相关蛋白水平的变化,以此深入研究癫痫发病的分子生物学机制、探讨ghrelin的抗癫痫作用及潜在的机制。本研究分三个部分:第一部分氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型的建立及脑电图、海马神经元损伤的病理学观察目的观察氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠行为学、电生理及海马病理学改变,探讨癫痫发作引起的海马神经元损伤。方法成年雄性Wistar大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发SE,观察大鼠行为学变化。SE持续60 min后腹腔注射地西泮终止发作。在致痫后2 h对大鼠进行脑电图(EEG)描记,观察大鼠脑电活动的改变。癫痫发作后72 h用多聚甲醛灌注取脑,石蜡包埋切片,HE和Nissl染色观察大鼠海马神经元的损伤。结果1.氯化锂-匹罗卡品诱发大鼠SE的成功率为93.3%(根据Racine发作评分标准,达到Ⅳ-Ⅴ级发作的大鼠被认为成功诱发SE,表现为双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起及全面性强直-阵挛发作,双侧后肢强直、身体背曲强直、跌倒),急性期死亡率为6.7%。2.癫痫发作后2 h(急性期)大鼠皮层和海马区的EEG均表现为丛集性棘波放电。3.HE和Nissl染色显示:正常大鼠海马CA1和cA3区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。癫痫发作后72 h大鼠海马CA1和CA3区部分神经元脱失、细胞排列紊乱,胞质浓缩,核固缩,胞浆内尼氏小体减少。结论根据氯化锂-匹罗卡品腹腔注射后大鼠行为学和EEG的改变说明氯化锂-匹罗卡品可致大鼠急性癫痫发作(即SE),氯化锂.匹罗卡品致痫后可引起大鼠海马神经元损伤。第二部分氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马PI3K/Akt信号通路以及凋亡相关蛋白水平的变化目的研究氯化锂-匹罗卡品致痫后不同时程大鼠海马PI3K/Akt信号通路及线粒体凋亡相关蛋白-Bax、Bcl-2和活性caspase-3水平的变化,进一步探讨癫痫后大鼠海马神经元损伤的分子生物学机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、癫痫发作后2 h、8 h、16 h、24 h和72 h组。在相应的时间点断头取脑,分离海马,提取蛋白,用Westem blot法检测各组大鼠海马磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylatedphosphatidylinositol-3-kinase,phospho-PI3K p85)、磷酸化Akt(phospho-Akt)、Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。结果1.大鼠海马phospho-PI3K p85和phospho-Akt的水平在癫痫发作后2 h和8 h明显的反应性增高(p＜0.05),而8 h后则逐渐下降并且于发作后16 h开始显著低于正常对照组的水平(p＜0.05)。2.癫痫发作后不同时程大鼠海马Bax的表达均显著高于正常对照组(p＜0.05),而Bcl-2的水平则较正常对照组明显降低(p＜0.05);另外,在癫痫发作早期caspase-3无活性,直到癫痫发作后24 h caspase-3才被激活并一直持续至发作后72 h(p＜0.05)。结论氯化锂-匹罗卡品所致的癫痫发作可抑制PI3K/Akt信号通路的激活,从而进一步调节线粒体凋亡相关蛋白的表达,最终激活caspase-3,导致细胞死亡。本研究阐明了癫痫后海马神经元损伤的分子生物学机制,为癫痫的神经保护治疗提供了理论依据。第三部分Ghrelin对匹罗卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用目的研究外源性ghrelin对匹罗卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用,以及对癫痫后大鼠海马PI3K/Akt信号通路,线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和活性caspase-3的作用,探讨ghrelin的抗癫痫作用及潜在的神经保护作用的机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、匹罗卡品组、匹罗卡品+生理盐水组和匹罗卡品+ghrelin组。癫痫发作后72 h灌注取脑,Nissl染色观察大鼠海马神经元损伤情况,测定CA1和CA3区神经元存活数;癫痫发作后24 h断头取脑,分离海马,实时定量PCR和Western blot法检测大鼠海马生长激素促分泌受体-1α(GHSR-1α)mRNA和蛋白的表达;Western blot法分别检测海马phospho-PI3K p85、phospho-Akt、Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平;另外,免疫组织化学法测定癫痫发作后24 h大鼠海马Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果1.Nissl染色显示正常大鼠海马CA1和CA3区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。癫痫发作后72 h大鼠海马CA1和CA3区部分神经元脱失、细胞排列紊乱,胞质浓缩,核固缩,胞浆内尼氏小体减少。Ghrelin干预组大鼠海马CA1和CA3区锥体细胞边缘清晰,结构正常,仅有少量细胞出现染色质凝集。2.癫痫发作后72 h大鼠海马CAl和CA3区存活的神经元数(105.8±10.8;116.5±12.9)较正常对照组(241.5±24.5;265.5±24.3)明显减少(p＜0.05),而ghrelin明显减少癫痫引起的细胞丢失(201.3±17.7;217.5±20.0)(p＜0.05),匹罗卡品组和匹罗卡品+生理盐水组(103.75±9.8;112.7±10.3)的神经元存活数量无显著性差异。3.癫痫发作后24 h大鼠海马GHSR-1αmRNA和蛋白的表达与正常对照组相比均无显著性差异,ghrelin干预后其表达也未出现统计学差异。4.与匹罗卡品组(癫痫发作后24 h)相比,Ghrelin给药后,降低的phospho-PI3Kp85、phospho-Akt和Bcl-2水平显著升高(p＜0.05),而升高的Bax和有活性的caspase-3水平则明显降低(p＜0.05)。匹罗卡品+生理盐水组各项指标的水平与匹罗卡品组的无明显差异。5.免疫组化结果:匹罗卡品致痫后,大鼠海马CA3区Bax阳性神经元染色强度较正常对照组明显升高(p＜0.05),而Bcl-2的染色强度则显著降低。Ghrelin干预后,大鼠海马CA3区Bax阳性神经元染色强度较匹罗卡品组显著降低(p＜0.05),而Bcl-2的则显著升高(p＜0.05),匹罗卡品+生理盐水组的CA3区Bax和Bcl-2阳性神经元的染色强度与匹罗卡品组相比均无明显差异。结论Ghrelin对癫痫大鼠海马神经元具有保护作用,这种保护作用是通过激活PI3K/Akt信号通路和抑制线粒体凋亡通路来发挥的。Ghrelin对癫痫发作引起的海马神经元死亡具有潜在的治疗价值,为癫痫的治疗提供了新的前景。研究意义本课题应用氯化锂一匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,深入研究了PI3K/Akt信号通路和线粒体凋亡通路在癫痫发作致海马神经元损伤中所起的作用,首次证实了ghrelin在匹罗卡品所致癫痫中可以通过调节PI3K/Akt信号通路和线粒体凋亡相关蛋白发挥神经保护作用。尽管在研究中并未发现ghrelin能减轻癫痫发作的程度,但研究结果阐明了癫痫致海马神经元损伤的分子生物学机制及ghrelin的神经保护作用机制,为癫痫的神经保护治疗提供了新的思路。