蛋白质是食品中一种重要的组分,在食品加工及贮藏过程中,蛋白质的稳定性对食品营养、功能特性及产品货架期有着重要的影响。饱和多羟基化合物,如糖和多元醇,具有提高蛋白质稳定性的作用。甘油是一种被广泛应用的食品添加剂,因其是最简单的多元醇,也被用于研究多元醇提高蛋白质稳定性的机理。目前甘油提高蛋白质稳定性被认为是一种非特异性作用。然而我们发现甘油对不同球状蛋白稳定性的影响方式存在差异,但作用机理还不清晰。因此本文以β-乳球蛋白和α-乳白蛋白为主要研究对象,分别探讨在高蛋白含量(50%)和低蛋白含量(5%)两种模型体系中,甘油对不同球状乳蛋白稳定性影响的差异及机理。首先,建立高蛋白含量的蛋白/甘油/水模型体系,研究不同浓度甘油对β-乳球蛋白和α-乳白蛋白热力学稳定性的影响及其变化趋势。差示扫描量热(DSC)结果显示β-乳球蛋白变性温度随甘油浓度增加呈线性升高,而α-乳白蛋白变性温度随甘油浓度先升高,当甘油浓度超过50%后,其变性温度逐渐降低;β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的变性焓均随甘油浓度的增加而减小。另外,以乳铁蛋白和溶菌酶作为参照蛋白,验证甘油对不同球状蛋白稳定性影响的差异。一方面,乳铁蛋白和α-乳白蛋白同为金属离子结合蛋白,同时,表面静电势分析显示α-乳白蛋白和乳铁蛋白都具有连续的同性电荷集中区域。DSC结果显示乳铁蛋白变性温度随甘油浓度的变化趋势与α-乳白蛋白一样,且与其离子结合状态和pH无关。另一方面,溶菌酶与α-乳白蛋白具有相似的二级结构和三级结构,但溶菌酶是非离子结合型蛋白,其变性温度随甘油浓度的变化趋势与β-乳球蛋白一样,这可能是由于稳定溶菌酶和β-乳球蛋白结构的主要作用为疏水相互作用,而且β-乳球蛋白和溶菌酶没有连续的同性电荷集中区域。另外,拉曼光谱研究显示甘油并不会影响蛋白质的二级结构。因此,稳定蛋白的主要作用力和蛋白质表面电荷分布的差异可能是导致蛋白稳定性随甘油浓度变化差异的原因。其次,建立低蛋白含量的蛋白/甘油/水模型体系,分别研究中低浓度的甘油(0~60%)对β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的构象稳定性影响。一方面,对于β-乳球蛋白,微量热DSC结果表明5%β-乳球蛋白变性温度随甘油浓度呈线性升高,与其在高蛋白含量模型体系中的热稳定性变化趋势一致。采用光谱法表征甘油对β-乳球蛋白单体分子结构的影响,远紫外圆二色谱(CD)结果显示β-乳球蛋白二级结构不随甘油浓度发生变化;近紫外CD结果表明芳香氨基酸残基的溶剂暴露程度随甘油浓度增加而降低,说明甘油可以促进分子内部的疏水相互作用;荧光光谱研究表明处于分子表面的Trp61内源荧光被二硫键Cys60-Cys160淬灭,这说明甘油溶液中β-乳球蛋白表面柔性区域的疏水残基更靠近疏水区域。小角X射线散射(SAXS)结果显示β-乳球蛋白在甘油溶液中以二聚体形式存在,其中两个单体相对位置随甘油浓度的增加而发生变化,导致二聚体的回转半径(R_g)增加,但不会引起二聚体的解离。分子动力学(MD)模拟结果显示甘油可以降低β-乳球蛋白构象柔性,并增强两个单体之间的静电相互作用。另一方面,对于α-乳白蛋白,微量热DSC结果表明在不同蛋白浓度模型体系中,α-乳白蛋白变性温度随甘油浓度的变化趋势一致。远紫外CD结果显示α-乳白蛋白的二级结构不随甘油浓度发生变化。近紫外CD结果表明甘油浓度大于50%时,芳香氨基酸残基的溶剂暴露程度增加。色氨酸内源荧光强度随甘油浓度增加而降低,表明蛋白质表面的疏水氨基酸残基更靠近疏水区域。SAXS结果显示当甘油浓度达到60%时,α-乳白蛋白两个叶状区域的质心间距增加,但SAXS结合MD模拟研究表明α-乳白蛋白R_g几乎不变,表明蛋白质结构内部的电子云分布改变,α-乳白蛋白分子内部的电子互斥作用增强。MD模拟结果显示甘油浓度增加使得α-乳白蛋白中短的α-螺旋结构和无规卷曲区域的构象柔性降低,但钙离子结合区域的构象柔性不受甘油浓度影响。选取钙离子结合区域肽段和离子建立模型分子簇,对该分子簇进行量子化学计,结果表明不同甘油浓度条件下,参与配位的配体氧原子的氨基酸残基来源发生了变化,甚至在60%甘油中,与钙离子配位的配体氧原子的数量减少,所以削弱了钙离子对α-乳白蛋白净负电荷集中区域的电荷补偿作用。而后,在低蛋白含量的蛋白/甘油/水模型体系中,进一步研究高浓度甘油(>70%)对β-乳球蛋白和α-乳白蛋白构象稳定性的影响。由于在中低浓度甘油溶液中,甘油浓度对蛋白质溶剂化层的影响较为复杂,所以为了简化模型体系,采用高浓度甘油体系,在这一部分研究中,假设蛋白质溶剂化层为甘油,便于直接研究甘油对蛋白质构象的影响。我们通过基于美拉德糖基化反应的方法来研究β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在甘油中的构象取向差异,引入葡萄糖作为探针分子,建立蛋白/葡萄糖/甘油模型体系。邻苯二甲醛测定结果表明甘油会加速美拉德糖基化反应,且反应速率与甘油浓度呈正相关,表明甘油可能影响游离氨基的质子化平衡。液相质谱结果显示高浓度甘油中,相同糖基化程度的蛋白质的糖基化位点选择性与甘油浓度无关。在平均取代度约为5的糖基化β-乳球蛋白中检出7个糖基化位点,分别为Leu1、Lys8、Lys 70、Lys 75、Lys 77、Lys 100和Lys135;而在平均取代度约为3的糖基化α-乳白蛋白中检出4个糖基化位点,分别为Glu1、Lys 13、Lys 94和Lys 122。与水中的糖基化位点相比,β-乳球蛋白在甘油中没有特异性反应位点,但α-乳白蛋白中Glu1为甘油中的特异性糖基化位点,Glu1处于α-乳白蛋白表面净负电荷集中区域,说明甘油促进α-乳白蛋白N端氨基去质子化并使其远离净负电荷集中的区域,从而提高其糖分子可及性。最后,采用量子化学计算,对比研究在纯甘油和纯水两种溶剂环境中,蛋白质局部的氨基酸残基稳定性及其相互作用。结果显示,侧链解离的酸性氨基酸残基和侧链非质子化的碱性氨基酸残基在甘油中的稳定性比在水中低,其中电负性原子的电子离域效应在甘油中更强,甘油介电常数小于水,因此也会增强电子的互斥效应。甘油不会削弱电中性氨基酸残基之间弱相互作用,但可以降低其非极性侧链与溶剂场之间的排斥效应。因此甘油对蛋白质表面残基侧链之间的相互作用表现为两个方面,一方面甘油会稳定电中性侧链,尤其是疏水侧链,利于蛋白质的稳定;另一方面甘油会增加电负性侧链之间的排斥作用,不利于蛋白质稳定。总之,甘油对球状乳蛋白稳定性影响的差异取决于稳定蛋白主要作用力和蛋白质表面电荷分布。从动力学角度看,甘油有利于与稳定蛋白质内部疏水核以及降低构象的柔性,这有利于提高蛋白质稳定性。从量子化学角度看,甘油会增强氨基酸残基侧链中电负性原子中的电子离域,同时增强库伦相互作用。因此,对于疏水相互作用主导的蛋白(β-乳球蛋白),若其表面没有同性电荷集中区域,则其稳定性随甘油浓度的增加而单调增加;而对于表面有同性电荷集中分布区域的蛋白(α-乳球蛋白),当甘油导致的库伦排斥作用强于稳定蛋白质构象的作用时,其稳定性随甘油浓度的增加而降低。