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目的:肠道菌群产物氧化三甲胺(TMAO)具有致动脉粥样硬化(AS)作用。TMAO已经成为AS防治的潜在靶点,通过控制饮食、减少肠道菌群TMAO的生产、抑制TMAO前体化合物的生成、TMA向TMAO的转化等,是调控TMAO致AS作用的新途径。我们的前期发现,TMAO具有致血管内皮细胞焦亡的作用,故本文旨在研究具有良好抗AS作用的姜黄素是否能拮抗TMAO致血管内皮细胞焦亡,并探讨其作用机制。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并传代,MTT法检测姜黄素对细胞存活的影响,得到合适的姜黄素浓度。然后研究姜黄素对TMAO致HUVEC焦亡相关分子表达的浓度效应(0μM、20μM、40μM、60μM)和时间效应(0h、6h、12h、24h),得到其最佳的作用浓度和时间,研究线粒体基因UQCRC1在TMAO致血管内皮细胞焦亡中的作用。按照siRNA说明书,向HUVEC细胞转染线粒体基因UQCRC1的siRNA,UQCRC1siRNA序列为siRNA:5,-GCAGAACTGTAGTCTGGAA-3,。蛋白质免疫印迹法检测蛋白质表达水平,实时荧光PCR检测mRNA,BCA法测定样品蛋白的含量,分光光度法检测ATP水平,DCFH-DA检测ROS,生物信息学在线网站分析UQCRC1基因启动子序列的CG岛。所有数据的统计学分析采用均数±标准差(x±SD)表示,用Graphpad Prism5.0.1对数据进行分析和作图,选取95%可信区间,P<0.05为差异有显著性意义。结果:(1)用0μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM的姜黄素处理HUVEC细胞,测定其OD值。可见与0μM相比较,20μM、40μM、60μM姜黄素与0μM相比较,无显著差异,而80μM和100μM姜黄素的细胞活力显著下降。因此,后续实验姜黄素的浓度均使用60μM及60μM以下。(2)将细胞培养至70%左右时,在加入TMAO,两个小时后加入不同浓度的姜黄素(0μM、20μM、40μM、60μM)继续培养。Western blot检测焦亡相关蛋白的表达。结果显示,与对照组相比较,TMAO显著上调焦亡相关分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β的蛋白表达水平,加入姜黄素后,TMAO上调焦亡相关分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β表达被显著抑制,且具有浓度效用,随着姜黄素浓度的增加,细胞焦亡相关蛋白的表达水平降低,并呈现出一定的浓度依赖性。但对于Caspase-1、NLRP3、IL-1β来说,其浓度依赖性又不完全相同。其中IL-1β以40μM姜黄素的抑制效果最佳,60μM姜黄素组IL-1β的水平反而高于40μM姜黄素组;姜黄素作用对Caspase-1的测定结果与IL-1β类似,但不如IL-1β的测定结果那样明显;NLRP3的测定结果则具有明显的浓度效用,20μM、40μM、60μM姜黄素,随其浓度升高,NLRP3下降的趋势越大。(3)用40μM的姜黄素处理内皮细胞不同的时间(0h、6h、12h和24h),Western blot检测焦亡相关蛋白的表达。结果发现,与对照组比较,TMAO明显上调细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β表达水平,加入姜黄素后,呈时间依赖性的下调细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β的表达水平。其中,6h的这3个分子表达水平与TMAO组比较无显著差异,12h和24h的这3个分子与TMAO组比较,均有显著差异,但以24h下降最为明显,具有统计学意义。(4)使用ROS检测试剂盒对空白组、TMAO组以及姜黄素+TMAO组ROS水平进行检测。实验结果显示,TMAO组荧光强度比对照组明显增加,而加入姜黄素后,与TMAO组比较,荧光强度有所减弱。这一结果说明,TMAO能促进HUVEC ROS的生成,姜黄素能部分逆转TMAO对ROS的诱导生成。(5)用ATP检测试剂盒,对空白组、TMAO组以及姜黄素+TMAO组的ATP产生水平进行检测。结果发现,TMAO显著下调HUVEC细胞ATP水平,而40μM姜黄素能拮抗TMAO的作用,与TMAO组比较,差异有显著性(P<0.05)。但姜黄素并不能完全逆转TMAO对ATP的降低作用。(6)TMAO显著下调UQCRC1的表达水平,而可被姜黄素部分逆转。(7)使用RNA干扰的手段沉默UQCRC1基因,抑制UQCRC1的表达。首先合成了3条UQCRC1siRNA,转染HUVEC,测定转染效率,结果发现这3条UQCRC1siRNA的沉默效果均较理想,与对照组比较,均显著抑制了UQCRC1的表达。(8)UQCRC1沉默后,焦亡相关分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β的表达水平显著升高,而加入姜黄素干预后,焦亡相关分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β的表达水平显著回落,甚至低于对照组的水平。(9)UQCRC1干扰后,ROS水平明显上升,而当加入姜黄素以后,ROS的产生明显回落。ATP的趋势与ROS相同。(10)通过生物信息学分析,在UQCUC1基因启动子上发现了一个CpG岛,经600μM的TMAO处理24h,TET2的蛋白表达水平显著下降,但加入40μM姜黄素处理进行干预,TET2的表达水平又部分恢复。这一结果说明,DNA羟甲基化酶TET2的表达受到TMAO和姜黄素的调控,且2者的作用相反,即TMAO下调TET2的表达,而姜黄素则可能上调TET2的表达。结论:姜黄素通过上调UQCRC1的表达,拮抗TMAO诱导的HUVEC焦亡及线粒体功能障碍。