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世界上半数人口都以稻米为主食,随着人们生活水平的不断提高,人们越来越注重稻米的品质。稻米中富含优质蛋白,其营养价值较高,但水稻中的蛋白缺乏赖氨酸,影响稻米的营养利用率。因此,如何提高稻米中第一限制性氨基酸即赖氨酸的含量,是现在育种家们密切关注的问题。在高等植物中赖氨酸的代谢是一个比较复杂的过程,其合成主要是依赖天冬氨酸代谢途径的一个分支,其中,两个关键酶分别是天冬氨酸激酶(AK)和二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS),这两个酶受到赖氨酸反馈抑制调控,赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)是控制赖氨酸降解途径的一个关键酶。本实验室在前期研究中通过基因工程手段,培育了大量赖氨酸代谢调控相关的转基因水稻材料,包括在水稻中表达大肠杆菌AK和DHPS基因,并且同时抑制LKR基因的表达(35R和GR)。此外,本实验室还对水稻内源的AK和DHPS基因进行改造,获得对赖氨酸反馈抑制不敏感AK2和DHPS1基因;在水稻中过表达改造的AK2和DHPS1基因且同时抑制LKR的表达,获得不同的转基因水稻材料(35ADL和35A2D1L)。本实验主要以这些不同的转基因系及其亲本为材料,分别对其基因表达、氨基酸含量、稻米理化品质等进行分析比较,主要研究结果如下:1、在前期研究中,本实验室已获得包含大肠杆菌AK和DHPS基因的35R以及GR等转基因纯合系。为了探究更完善的提高水稻赖氨酸含量的方法,本实验室主要以武香粳9号为受体,过表达水稻内源AK和DHPS基因、以及对其改造后的AK2、DHPS1基因,同时抑制其分解代谢基因LKR的表达(LKR-RNAi),获得大量不同的转基因系,经过连续多代自交和目的基因的PCR筛选,除35A2-44和35A-34之外,其他皆筛选到转基因纯合系。2、对转基因水稻发育籽粒中目的基因和蛋白表达分析,含有LR-RNAi结构的转基因水稻的LKR基因表达量都有不同程度的下降。导入大肠杆菌的AK和DHPS基因的水稻中可高效表达大肠杆菌的AK、DHPS基因,而对水稻的AK、DHPS基因的表达量没有明显影响。导入水稻内源的AK、AK2、DHPS、DHPS1基因的水稻籽粒中的AK和DHPS的表达量相比于对照都有所提高。Western blot结果检测的蛋白表达量与转录水平基本一致。3、对各转基因水稻成熟种子赖氨酸的测定结果分析,各转基因水稻中的游离赖氨酸含量相比于对照,有不同的程度的提高。其中显著提高的转基因系包括:35ADL-207、35ADL-208、35A2D1L-10、35A2D1L-32、35A2D1L-33 分别提高了 22、41、58、39、13 倍,其总赖氨酸含量也相应提高。另外,AK-52、DHPS-22和Ri的杂交聚合系的成熟籽粒中游离赖氨酸含量与亲本对照相比也有显著提高。4、转基因水稻的相关理化品质分析结果显示,部分转基因稻米米粉的表观直链淀粉和胶稠度与亲本对照相比有所变化,米粉的RVA谱特征值也表现相同的差异趋势。但其淀粉的RVA谱分析,仅有Ri-17/DHPS-22的淀粉RVA谱相比较于野生型的差异较大。5、对各转基因水稻纯合系的田间农艺性状的调查结果,所有转基因水稻的分蘖、主穗粒数没有变化,少部分水稻的主穗长、千粒重、结实率与亲本有所差异,而大部分的转基因植株的株高相比于野生型都有明显变矮。