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胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1(insulin-like growth factors binding protein1)是胰岛素样生长因子结合蛋白家庭的重要成员,是低氧环境中对IGF信号系统进行调控的关键因子。IGFBP-1蛋白通过与胰岛素样生长因子(IGF)结合,调控IGF信号转导通路,调节包括躯体生长、发育以及机体低氧耐受等功能。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)生长迅速,草食性,是我国淡水养殖的四大家鱼之一,2008年,我国草鱼总产量已达356万吨。本研究展开了草鱼IGFBP-1基因的结构和功能研究,并深入研究了IGFBP-1基因在鱼类生长发育及低氧耐受调控机制,研究结果可对草鱼的生长和抗低氧性状品种的选育提供理论指导。
主要研究结果如下:
(1)利用RACE技术克隆了草鱼IGFBP-1基因的全长cDNA序列1135bp,其开放阅读框长为789bp,编码262个氨基酸。草鱼IGFBP-1cDNA的5’非编码区存在3个mRNA瞬间降解信号;其3’非编码区存在3个瞬时降解信号,2个胰岛素反应元件(IRE),1个低氧诱导因子辅助元件(HAS),表明IGFBP-1受胰岛素和低氧诱导因子的调控。同源比较结果显示,草鱼与斑马鱼的序列相似性为93%,与其它14种脊椎动物的同源性介于38%~94%之间,其N端和C端具很高的保守性,同源性在70%以上。
(2)胚胎不同时期RT-PCR表明,草鱼胚胎期IGFBP-1 mRNA的表达水平很低,在受精后4hrs和8hrs胚胎未能检测到转录本,受精12hrs后,也仅能检测到微量表达。成鱼不同组织或器官RT-PCR结果显示,草鱼IGFBP-1 mRNA在肝脏、肾脏、肠和心脏组织中具有表达活性,其中肝脏和心脏表达量最高,肾脏和肠次之。
(3)进行了草鱼胚胎、25天仔鱼、3月龄幼鱼低氧胁迫实验,发现低氧对草鱼IGFBP-1mRNA的表达水平具有显著的正调控作用。在草鱼胚胎期,低氧胁迫可显著调高IGFBP-1的转录水平,并与低氧胁迫时间呈正相关;在25天仔鱼中,其mRNA的表达量也增加,但与低氧胁迫时间无成正比关系;在3月龄幼鱼中,低氧胁迫使得肝脏和脑中的IGFBP-1转录水平明显上升,在正常溶氧环境中恢复24hrs后,草鱼脑IGFBP-1的转录水平可基本恢复正常,而肝脏中虽然表达水平回落,但仍然明显高于正常水平。
(4)进行了草鱼6月龄幼鱼饥饿胁迫实验。结果显示,饥饿也可使草鱼肝脏IGFBP-1 mRNA的表达明显上升,且与饥饿时间成正比,恢复喂食后6天,表达水平恢复正常;而饥饿对于脑中的IGFBP-1转录水平则没有明显的影响。表明草鱼肝脏IGFBP-1的转录水平受营养水平调控。
(5)通过在斑马鱼胚胎中过量表达IGFBP1和IGFBP1-eGFP,我们观察到了斑马鱼胚胎发育延迟和生长受阻现象。在IGFBP1-eGFP加帽mRNA显微注射斑马鱼胚胎中,可能是融合蛋白破坏了eGFP的高级结构,报告基因eGFP并没有在注射胚胎中产生绿色荧光,但在24hpf注射胚胎中观察到了明显的发育延迟现象;在IGFBP1加帽mRNA显微注射斑马鱼胚胎中,也同样观察到了胚胎发育延迟和生长受阻现象;这些结果表明:过量表达的IGFBP-1可竞争性结合IGF-1,降低IGF配体的浓度,从而引发斑马鱼胚胎发育延迟和生长受阻。