研究目的本实验的研究重点旨在探讨调肝药物对应激状态PC12细胞自噬的调节机制。从细胞自噬此微观角度探讨中医肝藏象理论的生理与病理机制,以慢性心理应激损伤为切入点,运用调肝法对细胞自噬失调状态的影响,从而初步论证肝主疏泄功能与细胞自噬的内在关系。证明课题组所提出“细胞自噬调节,是肝主疏泄全身气机在细胞层次的表现形式”理论假说的科学性。从而丰富和创新中医藏象理论,并为调肝治法对治疗慢性应激损伤提供实验的依据。实验方法和内容一、皮质酮处理PC12细胞造成应激损伤状态的细胞模型建立等比例的皮质酮800μM、400μM、200μM、100uM、50μM以及无水乙醇组和对照组进行实验,通过MTT检测方法对每组的细胞进行细胞活性检测。二、柴胡皂苷A与芍药苷对应激损伤状态PC12细胞自噬的形态学观察1、用不同工作浓度芍药苷与柴胡皂苷A作用于正常的PC12细胞,观察这两种单体是否会影响细胞的活性。2、用不同工作浓度芍药苷与柴胡皂苷A作用于应激损伤的PC12细胞,通过MTT检测方法选出不同浓度芍药苷与柴胡皂苷A之中,细胞活性最佳的一个浓度进行下面的实验。3、根据以上的实验,把细胞分为空白组、模型组、芍药苷组、柴胡皂苷A组,分别处理后,通过电镜观察它们的自噬相关结构；通过运用含有自噬双标的腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染观察各组细胞自噬体/自噬溶酶体的比值,从而监测自噬流的过程。三、柴胡皂苷A与芍药苷调节细胞自噬作用机制的初步研究运用RT-PCR检测方法,了解各组细胞LC3II/I, P62的mRNA表达情况；运用Western Blot检测方法检测LC3II/I、P62以及p-mTOR的蛋白表达情况。从而进一步了解自噬体-自噬溶酶体一蛋白降解的情况。实验结果一、皮质酮处理PC12细胞造成应激损伤状态的细胞模型建立随着皮质酮浓度升高,细胞活性逐渐降低。与空白组相比,CORT 800μM、CORT 400 μM, CORT 200μM, CORT 100μM的细胞活性都显著下降(P<0.01)；CORT 50μM细胞活性下降(P<O.05)；无水乙醇组细胞活性与空白组相比,没有统计学差异。当皮质酮浓度为400 u M时,细胞存活率最接近40%。二、柴胡皂苷A与芍药苷对应激损伤状态PC12细胞自噬的形态学观察1、用不同工作浓度芍药苷与柴胡皂苷A作用于正常的PC12细胞,没有对正常的PC12细胞造成明显的影响,差异没有统计学意义。2、用不同工作浓度芍药昔与柴胡皂苷A作用于应激损伤的PC12细胞,通过MTT检测发现与空白组相比,模型组的细胞活性显著下降(P＜0.01),DMSO组细胞活性没有明显改变；与模型组相比,400μM、200μM、100μM芍药苷都会有所提高细胞活性(P＜0.01),其中400μM 芍药苷组细胞活性最高,50μM,25μM芍药苷与模型组的差异没有统计学意义。10μM、5μM、2.5μM、1.25μM柴胡皂苷A也会明显提高细胞活性(P<0.01),0.625 μ M柴胡皂苷A细胞活性没有统计学差异。由于芍药苷组之中400 μ M的细胞活性最佳,所以选用400 μ M 芍药苷进行后面的实验；而10 μ M、5 μ M柴胡皂苷A的细胞活性相近,柴胡皂苷A组则选用5 μ M进行后续实验。3、通过电镜与自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染对细胞自噬相关结构进行观察,根据电镜图片发现与空白组相比,模型组的自噬体生成明显增多。与模型组相比,芍药苷组与柴胡皂苷组的自噬体数量明显减少。又根据自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染的观察结果发现空白组无论是红色荧光点还是黄色荧光点都非常少。与空白组相比,模型组的红色、黄色荧光点明显增多(P<0.01),其中黄色荧光增多更明显。与模型组相比,芍药苷与柴胡皂苷A的红色荧光点有显著下降(P<0.01)；芍药苷与柴胡皂苷A的黄色荧光点数量也有明显的减少,其中芍药苷组更为显著(P<0.01)。黄/红的比例即：自噬体/自噬溶酶体的比例,比值越大说明自噬流在自噬体转变成自噬溶酶体的过程中,受到越大的障碍。与空白组相比,模型组的黄(自噬体)/红(自噬溶酶体)比值显著增大(P<0.01)；与模型组相比,芍药苷组与柴胡皂苷A组的黄/红比值有所下降,其中芍药苷组比较显著(P<0.01),而柴胡皂苷A组没有那么显著(P<0.05)。三、柴胡皂苷A与芍药苷调节细胞自噬作用机制的初步研究由RT-PCR结果可知,与空白组相比,模型组P62 mRNA的表达水平和LC3II的mRNA表达水平明显的升高(P<0.01)；而与模型组相比,芍药苷组能显著减少P62和LC31ImRNA的表达(P<O.01)；柴胡皂苷A也能明显减少P62和LC3II mRNA的表达(P<O.01),但其中P62和LC3II mRNA表达的程度没有芍药苷组明显。而Western Blot检测结果可知,与空白组相比,模型组LC3II/I和P62蛋白表达量也明显升高(P<0.01),而p-mTOR蛋白表达会显著减少(P<0.01);与模型组相比,芍药苷组会显著降低LC3II/I和P62蛋白的表达(P<0.01),而p-mTOR蛋白则没有明显的变化;柴胡皂苷A与模型组相比,也会显著降低LC3II/I蛋白的表达(P<0.05)；显著降低P62蛋白的表达(P<0.05),但P62的下降程度没有芍药苷组明显；p-mTOR蛋白的表达则没有明显的差别。实验结论一、通过400 μ M皮质酮处理高分化PC12细胞,能够模仿处于应激状态神经元的模型,模型组的细胞活性明显下降。二、被皮质酮损伤的PC12细胞中,发现其自噬体明显增多,但是自噬溶酶体增长的幅度并不明显,说明细胞自噬功能启动被激活,但自噬流的过程被明显抑制。三、芍药昔与柴胡皂苷A能有效缓解模型组的自噬流被抑制的状态,提高细胞自噬活性,从而提高细胞活性,其中芍药苷的作用更明显。四、本研究进一步证实了“肝藏象的疏泄功能与细胞自噬调节功能相关,是肝疏泄功能在细胞层面的具体体现”的理论假说,丰富了“肝主疏泄”的藏象理论内涵。