灵芝是我国一种珍贵的传统药用真菌,已有几千年的应用历史。它具有多种重要的药理功能。近年研究表明,包括灵芝酸在内的三萜类化合物具有令人感兴趣的抗肿瘤活性。本实验室通过两阶段发酵的方法来高效生产灵芝酸,这为进行其药理药效研究提供了坚实的物质基础。至今,本实验室从灵芝发酵菌丝中分离得到六种灵芝酸单体(GA-T、-Me、-Mk、-Mf、-S和7-0-ethylGA-O),并在前期的研究中已证明GA-T和GA-Me具有良好的抑制肿瘤生长的效果,可诱导肿瘤细胞凋亡,并且具有抑制肿瘤转移的作用。但是,针对其它四种灵芝酸单体的生物活性尚未知,有待研究。另外,天然化合物的结构修饰往往是获得理想活性物质的一个有效手段,但至今尚未见有关灵芝酸的化学结构修饰来获得更佳抗肿瘤活性衍生物的报道。本学位论文首先使用MTT法证明富含灵芝三萜的组分对肿瘤细胞具有细胞毒性,而去除三萜组分的粗提物没有细胞毒性,确认发酵生产的灵芝菌丝体同天然灵芝子实体一样,三萜类化合物是其抗肿瘤活性的物质基础。接着,以四种肿瘤细胞(SW1990、HeLa、95D和HO-8910)为体外筛选模型,通过MTT法考察了实验室分离得到的六种灵芝酸单体(GA-T、-Me、-Mk、-Mf、-S和7-O-ethyl GA-O)对不同细胞的细胞毒性作用。结果表明,六种灵芝酸对肿瘤细胞都具有细胞毒性,其中GA-T细胞毒性最强。在实验浓度范围内,GA-T对肿瘤细胞的毒性呈剂量依赖型；而对正常成纤维细胞HF的毒性则较低,表明其具有良好的抗肿瘤选择性。另外,以人宫颈癌细胞HeLa作为模型,比较了GA-Mf和GA-S作为同分异构体的作用是否存在差异,结果表明GA-Mf比GA-S显示了更强的诱导细胞凋亡的能力,并且GA-Mf可以将HeLa细胞周期阻滞于Gl期,而GA-S将该细胞周期阻滞于S期。通过结构活性比较可知：GA-Mf和GA-S活性的差别可能是因为取代基位置的变化以及C-3位置的α/β构型的不同。三萜类化合物母核上具有多种取代基团,例如羟基、羧基和乙酰基等。这些基团赋予了三萜类化合物多样的生物活性,同时也为其化学修饰提供了位点,由此可能获得更有效的活性化合物。目前尚缺乏灵芝酸结构与抗肿瘤活性间关系的信息。本论文以上述活性最好的GA-T作为对象,针对其羧基和乙酰基进行了化学修饰,合成了酯化、酰胺化以及乙酰化程度不同的衍生物,并经NMR、MS等鉴定了衍生物的化学结构。其中有四个衍生物(TLTO-Ee、TLTO-Pe、TLTO-A和GA-T1)的结构是新颖的。以宫颈癌细胞HeLa细胞作为模型,对GA-T及其羧基端衍生物(TLTO-A、 TLTO-Me、TLTO-Ee和TLTO-Pe)的抗肿瘤活性及其机制进行了研究。结果表明：酰胺衍生物TLTO-A细胞毒性最强,而三种酯化衍生物TLTO-Me、TLTO-Ee、TLTO-Pe的细胞毒性与GA-T的细胞毒性相似,毒性顺序为：TLTO-A> GA-T≈TLTO-Me≈TLTO-Ee≈TLTO-Pe.这五种物质都将HeLa细胞周期阻滞于G1期。由于它们结构上的区别仅在于C-26位的不同取代基,表明C-26位取代基的改变并不影响灵芝酸对细胞的周期阻滞作用。进一步研究表明它们可以诱导HeLa细胞凋亡,在细胞凋亡的过程中,都伴随着线粒体膜电位的降低和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)活力的升高,证明这五种物质通过线粒体途径诱导肿瘤细胞发生凋亡。其中,TLTO-A具有最强的促凋亡活性。这些结果表明GA-T的C-26位羧基是一个有潜力的化学修饰位点。本学位论文还探讨了灵芝酸的乙酰化程度在其抗肿瘤活性中的作用。天然GA-T、GA-Mk和半合成的GA-T1和GA-T2的结构上分别有3个、2个、2个和1个乙酰基。考察了它们对HeLa细胞的毒性,其毒性大小依次为GA-T>GA-Mk≈GA-T1>GA-T2。接着研究它们诱导HeLa细胞凋亡的机理。实验结果表明,上述四种乙酰化程度不同的灵芝酸都可以抑制肿瘤细胞的抗氧化保护系统,包括降低谷胱甘肽(GSH)的含量并且抑制超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活力,并诱导细胞内和线粒体内活性氧的积累,过高的活性氧水平进一步诱导细胞通过线粒体途径发生凋亡；乙酰化程度越高的灵芝酸具有越强的诱导活性氧积累以及细胞凋亡的能力。通过外源添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、过氧化氢酶(CAT)和二苯基氯化碘(DPI),检测到灵芝酸诱导的活性氧的水平和caspase-3的活性显著降低。上述结果揭示了活性氧在灵芝酸诱导细胞凋亡中的介导作用。综上所述,本学位论文对灵芝酸的羧基和乙酰基进行了化学修饰,并对新型衍生物的抗肿瘤活性及机理进行了对比研究。这些结果有助于加深对灵芝酸结构与其抗肿瘤活性间关系的理解,对抗癌药物的研究开发具有良好的意义。