论文部分内容阅读
MicroRNAs (mirRNA)是一类长约22-25nt的非编码的单链RNA分子,广泛存在于植物,动物和人类的细胞中,通过碱基配对的方式结合到靶mRNA的3’非编码区(3’UTR),从而抑制其翻译。与肌肉发育相关的mirRNA有很多。其中miR-133b为肌肉特异性mirRNA,是myomiRs家族成员。目前关于1niR-133b在牛骨骼肌卫星细胞中的研究较少。为了探讨miR-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,本实验以原代培养的牛骨骼肌卫星细胞为实验材料,通过Real Time PCR检测正常培养的牛骨骼肌卫星细胞在增殖阶段miR-133b的表达量。构建了miR-133b真核过表达载体pcDNA3.1(+)-miR-133b,转染后采用EdU试剂盒检测miR-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,利用生物信息学方法预测miR-133b可能的靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证靶基因,转染miR-133b的真核过表达载体后,Real Time PCR和Western Blot检测SP1基因表达变化。结果表明：使用胶原酶XI与胰蛋白酶相结合的方法,经过差速贴壁成功分离了原代牛骨骼肌卫星细胞。细胞生长状态良好,在含有2%马血清的培养基诱导下,细胞能够分化并融合形成多核的肌管。与对照组相比,转染过表达载体pcDNA3.1(+)-miR-133b后,miR-133b表达量增加500倍,EdU细胞增殖实验结果表明,牛骨骼肌卫星细胞增殖明显增加,增殖率为26.2%,差异显著(p<0.05)。利用生物信息学方法预测miR-133b,其中包括SP1基因；在牛骨骼肌卫星细胞中进行双荧光素酶报告实验,miR-133b可抑制含SP13’-UTR双荧光素酶重组质粒表达的荧光素酶活性,但突变预测靶位点的种子区序列,miR-133b不能抑制突变重组质粒表达的荧光素酶活性；进一步Real Time PCR和Western Blot结果表明,与对照组相比,转染过表达载体pcDNA3.1(+)-miR-133b后,SP1基因的mRNA和蛋白水平明显降低；表明miR-133b通过靶向作用于SP1基因调节牛骨骼肌卫星细胞的增殖。结论：本实验结果表明miR-133b通过靶向作用于SP1基因调节牛骨骼肌卫星细胞的增殖。为进一步研究牛MyomiRs在细胞增殖中的分子调控机理提供了理论依据。