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抗体类药物以其特异性、多样性和作用机制明确等特点,被广泛运用于肿瘤的治疗中。单克隆抗体以及抗体药物偶联物是治疗型抗体的两大主要类型。本研究中,我们针对两种不同的肿瘤特异性标志物Mesothelin(间皮素)和Glypican-3(GPC3),分别研发了靶向Mesothelin的人源单域抗体SD1(只包含重链可变区VH)和靶向GPC3的免疫毒素HN3-PE38。一、新型抗Mesothelin的全人源单域抗体SD1的筛选及抗肿瘤活性的鉴定Mesothelin是肿瘤表面特异性标志物,分子量约为40kDa,通过Glycosylphosphatidylinositol (GPI anchor)锚定在细胞外膜。Mesothelin在多种恶性肿瘤组织中高表达,如胆管癌、间皮瘤、卵巢癌、非小泡肺癌和胰腺癌等,但在正常组织中表达量较低。目前,有几类靶向Mesothelin的治疗型抗体正在进行临床研究,其抗肿瘤活性主要是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)或与假单胞菌杆菌外毒素PE38融合成免疫毒素来实现的。由于其抗肿瘤机制比较单一,因此抗肿瘤活性并不理想。而补体介导的细胞毒作用(Complement-dependent cytotoxicity, CDC)是抗体的另一大抗肿瘤机制,但尚未在已知靶向Mesothelin的单克隆抗体发现。为了增强抗体治疗的效果,研发具备多种抗肿瘤机制的抗体用于肿瘤治疗,我们展开以下的研究：(1)通过对Mesothelin结构的分析,确定以Mesothelin C末端50个氨基酸序列为抗原表位,并运用噬菌体展示技术定向筛选,成功地筛选到一株靶向此特定表位的人源单域抗体SD1。(2)将SD1与人源IgGγ1Fc融合后的SD1-hFc融合蛋白可以特异地结合Mesothelin阳性肿瘤细胞。SD1-hFc不仅具有很强的ADCC活性,还具有CDC,并通过这两种不同的机制在体外特异性地杀伤Mesothelin阳性肿瘤细胞。这是目前第一株具有双重抗肿瘤功能的靶向Mesothelin阳性肿瘤细胞的人源单克隆抗体。(3)人源单域抗体SD1-hFc在荷瘤动物模型上通过CDC和ADCC活性有效地抑制肿瘤在体内的增殖。SD1-hFc可以为目前靶向Mesothelin阳性肿瘤细胞的治疗提供新的方式。二、靶向Glypican-3的免疫毒素与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂Irinotecan的联合抗肿瘤活性的研究GPC3是近年来发现的肝癌表面高特异性标志物,大小为70kDa,通过GPIanchor结构域锚定在细胞膜上。研究发现GPC3在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中高表达,但在正常肝组织中无任何表达。目前几类靶向GPC3的单克隆抗体正在进行临床前或临床研究,但由于这些抗体抗肿瘤机制比较单一,因此无法达到最佳的治疗效果,而且GPC3分子的结构和生物学功能目前仍不清楚,导致功能型抗体开发比较困难。由于GPC3分子在肝癌肿瘤组织中的高度特异性,使其非常适合作为抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugate, ADC)的靶标,而ADC可以作为一种替代手段绕过多功能单克隆抗体的研发从而达到较好的肿瘤治疗效果。在本研究中,首先通过分析GPC3分子在HCC细胞膜表面的拷贝数和能否自我内化,从而评估其作为ADC靶向标志物的可能性。然后将一种抗GPC3的人源单域抗体HN3与假单胞杆菌外毒素PE38融合后制备成免疫毒素HN3-PE38,用于评估其抗肿瘤的活性。研究结果表明：(1)GPC3分子在多种HCC细胞系如HepG2和Hep3B上高表达,每个细胞膜上分子拷贝数大于105个,并且GPC3分子在HCC细胞膜表面可以迅速内化。(2)将靶向GPC3的人源单域抗体HN3与改造过的假单胞菌杆菌外毒素PE38融合制备成免疫毒素HN3-PE38,在体外HCC细胞上具有很强的特异性杀伤活性,IC50可以达到10ng/ml左右。(3)在HCC细胞系HepG2和Hep3B的荷瘤裸鼠体内模型测试中,HN3-PE38免疫毒素可以有效地抑制HepG2肿瘤的增殖,并且可以诱导Hep3B肿瘤的消退。(4)在HepG2荷瘤裸鼠体内进行化合药物筛选,成功筛选得到具有很强抗肿瘤活性的化合药物Irinotecan(拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂),这是首次发现Irinotecan可以作用于肝癌肿瘤细胞。(5)将免疫毒素HN3-PE38与拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂Irinotecan联合使用,可以协同性地引起HepG2肿瘤消退,增加Irinotean的注射次数,可以达到完全清除HepG2肿瘤的目的。这种治疗方式为肝癌的治疗提供了新的方向综上所述,靶向Mesothelin的单域抗体SD1与靶向GPC3的免疫毒素HN3-PE38作为治疗型抗体的两大作用形式,通过不同的途径,有效地抑制肿瘤在体内外的增殖,为针对Mesothelin阳性肿瘤或GPC3阳性肝癌的治疗提供了新的途径。