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第一部分PTEN与FAK基因在胃癌中调控关系的研究目的：探讨胃癌细胞中,PTEN基因与FAK基因调控关系的研究。方法：(1)以胃癌细胞MKN-28、MKN-45、SGC-7901和BGC-823细胞为实验对象,分别在无任何处理、转染对照质粒GFP、PTEN野生型质粒(GFP-PTEN)条件下培养24小时,采用免疫印迹法检钡PTEN和FAK蛋白的表达。(2)以胃癌细胞MKN-28为实验对象,分别在无任何处理、转染对照质粒GFP、PTEN野生型质粒(GFP-PTEN)、PTEN脂质磷酸酶突变的质粒(GFP-PTEN-G129E)、PTEN脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶均突变的质粒(GFP-PTEN-C124S)条件下培养24小时,采用实时定量PCR及免疫印迹(Western-blot)法检测PTEN与FAK的mRNA水平和蛋白水平的变化,报告基因方法检测FAK启动子活性。(3)以胃癌细胞MKN-28为实验对象,分别在无任何处理、转染对照小分子干扰RNA(Control-siRNA)和PTEN小分子干扰RNA (PTEN-siRNA)条件下培养24小时,采用实时定量PCR及免疫印迹法检测PTEN、FAK和磷酸化FAK (p-FAKTyr-397)的mRNA水平和蛋白水平的变化,报告基因方法检测FAK启动子活性。结果：(1)与细胞转染对照质粒GFP组相比,细胞转染野生型PTEN质粒能够显著降低总FAK和p-FAK Tyr-397在蛋白水平和mRNA水平的表达,且两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(2)突变型PTEN质粒GFP-PTEN-G129E和GFP-PTEN-C124S则不能够影响FAK的表达。(3)与细胞转染Control-siRNA组相比,细胞转染PTEN-siRNA组能够显著升高FAK在蛋白水平和mRNA水平的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)过表达PTEN能够抑制FAK的启动子活性,而低表达PTEN能够增强启动子活性,且两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：PTEN蛋白通过其脂质磷酸酶活性,能够在蛋白水平和转录水平抑制FAK基因的表达；而PTEN蛋白酶活性则不能影响FAK基因的表达。第二部分PTEN基因通过FAK调控胃癌细胞转移和侵袭的研究目的：探讨PTEN抑制胃癌侵袭转移中的作用及其机制研究。方法：(1)以胃癌细胞MKN-28为对象,在无任何处理及分别转染质粒GFP、质粒GFP-PTEN、质粒GFP-PTEN联合质粒GFP(GFP-PTEN-GFP)、质粒GFP-PTEN联合野生型质粒FAK (GFP-PTEN-FAK)、质粒GFP-PTEN联合质粒FAK酪氨酸397位点突变质粒(GFP-PTEN-FAK-F397)和质粒GFP-PTEN联合质粒FAK酪氨酸925位点突变质粒(GFP-PTEN-FAK-F925)条件下培养24小时,应用体外细胞侵袭实验来检测细胞侵袭力。(2)MKN-28细胞在无任何处理、转染对照小分子干扰RNA (Control-siRNA)和PTEN小分子干扰RNA (PTEN-siRNA)条件下培养24小时,采用体外细胞侵袭实验来检测胃癌细胞侵袭力。(3)MKN-28细胞在无任何处理、转染质粒GFP、质粒GFP-PTEN (PTEN野生型)、质粒GFP-PTEN-G129E和质粒GFP-PTEN-C124S条件下培养24小时,采用间接免疫荧光法检测FAK蛋白的细胞定位。(4)构建裸鼠胃癌原位移植模型,观察无任何处理组、慢病毒对照载体GFP组和慢病毒目的载体GFP-PTEN组对肿瘤转移的不同影响。用免疫组化法检测PTEN和FAK的表达。(5)收集24例临床人胃癌组织及相应的癌旁标本,用免疫印迹法检测PTEN和FAK的表达。结果：(1)细胞侵袭实验结果显示,转染质粒GFP-PTEN组抑制胃癌细胞侵袭作用最强,质粒GFP-PTEN联合FAK酪氨酸397位点突变质粒组、质粒GFP-PTEN联合FAK酪氨酸925位点突变质粒组抑制作用次之；与质粒GFP-PTEN联合质粒GFP组、质粒GFP-PTEN联合FAK酪氨酸397位点突变质粒组和质粒GFP-PTEN联合FAK酪氨酸925位点突变质粒组相比,质粒GFP-PTEN联合野生型质粒FAK组对胃癌细胞MKN-28的侵袭抑制作用明显减弱了；质粒GFP-PTEN组与质粒GFP-PTEN联合野生型质粒FAK组相比差异有统计学意义(P<0.05)。(2)细胞转染si-RNA,侵袭实验显示：与对照干扰RNA组相比,转染PTEN-siRNA组对细胞的运动和侵袭抑制作用明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)细胞免疫荧光示：FAK蛋白主要在细胞的胞浆处表达,靠近细胞膜的边缘。转染质粒GFP-PTEN组(野生型PTEN)明显抑制粘着斑的表达,使其数量减少了,形状变小,亮度变弱。(4)建立裸鼠胃癌原位种植模型1月后处死裸鼠发现,慢病毒目的载体GFP-PTEN组抑制胃癌的腹膜和肝脏转移；慢病毒对照载体GFP组对胃癌的腹膜和肝脏转移抑制作用减弱。慢病毒目的载体GFP-PTEN组与慢病毒对照载体GFP组相比差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化法结果显示,PTEN蛋白主要在胞质表达,PTEN蛋白可以抑制FAK蛋白在胞质在胞质中的表达。(5)免疫印迹法检测显示：PTEN在胃癌组织中低表达,胃正常组织中高表达；结论：(1)PTEN无论在体内还是体外均能够抑制胃癌的侵袭与转移,FAK可增强胃癌细胞的侵袭与转移。(2)FAK可减弱PTEN对胃癌细胞侵袭、运动的抑制作用。(3)PTEN与FAK负相关,PTEN通过其脂质磷酸酶作用来抑制FAK表达,从而抑制胃癌细胞的侵袭与转移。第三部分PTEN调控FAK转录机制研究目的：探讨PTEN调控FAK基因转录的可能机制。方法：(1)使用PTEN小分子干扰RNA抑制PTEN蛋白表达。胃癌细胞MKN-28分别在转染对照小分子干扰RNA (Control-siRNA)、转染PTEN小分子干扰RNA(PTEN-siRNA)、转染对照小分子干扰RNA联合LY294002(10μM)(Control-siRNA+LY294002)、转染PTEN小分子干扰RNA联合LY294002(PTEN-siRNA+LY294002)、转染对照小分子干扰RNA联合NF-κB抑制剂PDTC (10μM)(Control-siRNA+PDTC)、转染PTEN小分子干扰RNA联合NF-κB抑制剂PDTC (10μM)(PTEN-siRNA+PDTC)条件下培养24小时。采用免疫印迹法和实时定量PCR法检测PTEN和FAK的表达。(2)细胞在转染对照小分子干扰]RNA (Control-siRNA)、转染PTEN小分子干扰RNA (PTEN-siRNA)条件下培养24小时。采用免疫印迹法检测PTEN、FAK、AKT(Ser473)、磷酸化AKT(p-AKT-Ser473、P65、磷酸化P65(p-P65)、IKBa、磷酸化IKBa (p-IKBa)和actin的表达。(3)胃癌细胞MKN-28分别在无任何处理、转染对照小分子干扰RNA(Control-siRNA)、转染PTEN小分子干扰RNA (PTEN-siRNA)、转染对照小分子干扰RNA联合LY294002(10μM)(Control-siRNA+LY294002)、转染PTEN小分子干扰RNA联合LY294002(PTEN-siRNA+LY294002)条件下培养24小时,采用电泳迁移率实验检测PTEN调控FAK转录通路及检测转录因子NF-κB的活性。(4)胃癌细胞MKN-28在无任何处理条件下培养24小时后,提取核蛋白,采用电泳迁移率及超迁移实验,用特异性的NF-κB探针和特异性NF-κB突变探针来检测转录因子NF-κB与FAK启动子的结合情况。(5)根据软件预测出NF-κB与FAK启动子的结合位置及序列,进行截断实验,截成6段载体,分别是P-1173、P-723、P-480、P-350、P-280和P-90。胃癌细胞转染各截断载体或联合转染慢病毒对照GFP载体或慢病毒过表达GFP-PTEN载体,采用报告基因实验方法进行FAK启动子活性的检测。(6)胃癌细胞转染截断载体包含2个NF-KB结合位点的序列的野生型P-480NF-κB-WT、突变型载体P-480NF-κB-up M、P-480NF-κB-lowM、P-480NF-κB doubleM或联合转染慢病毒对照GFP载体或慢病毒过表达GFP-PTEN载体,条件下培养24小时,采用报告基因实验方法进行FAK启动子活性的检测。(7)胃癌细胞MKN-28分别在无任何处理、转染质粒GFP、质粒GFP-PTEN(PTEN野生型)、质粒GFP-PTEN-G129E和质粒GFP-PTEN-C124S条件下培养24小时。采用染色质免疫沉淀法检测NF-κB与FAK启动子结合情况。结果：(1)转染PTEN-siRNA组中FAK在蛋白水平和mRNA水平表达较转染Control-siRNA组水平升高,且有统计学差异P<0.01；与转染PTEN-siRNA组相比,转染PTEN-siRNA联合LY294002(PTEN-siRNA+LY294002)组和转染PTEN-siRNA联合NF-κB抑制剂PDTC(10μM)(PTEN-siRNA+PDTC)组FAK在蛋白水平和1nRNA水平表达均降低,且有统计学差异(P<0.01)。(2)与转染Control-siRNA组相比,转染PPTEN-siRNA组显著促进FAK、磷酸化AKT(p-AKT-Ser473)和磷酸化P65(p-P65)表达,抑制磷酸化IKBa(p-IKBa)的表达,且两组相比差异有统计学意义(P<0.05)；AKT(Ser473)、P65和IKBa的蛋白表达却无显著性改变。(3)转染PTEN-siRNA组NF-κB活性较转染Control-siRNA组和转染PTEN-siRNA联合LY294002(PTEN-siRNA+LY294002)组NF-κB活性高。(4)生物素标记的野生型NF-κB特异性探针能够和NF-κB相结合,而生物素标记的突变型NF-κB特异性探针不能和NF-KB相结合。(5)PTEN能够抑制通过抑制NF-κB的活性降低FAK启动子的活性,NF-κB突变后PTEN对FAK启动子活性抑制作用减弱。(6)野生型质粒PTEN能够降低NF-κB与FAK启动子的结合力,而PTEN脂质磷酸酶突变的质粒(GFP-PTEN-G129E)和PTEN脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶均突变的质粒(GFP-PTEN-C124S)均对NF-κB与FAK启动子的结合力无显著影响。细胞转染质粒GFP组与转染GFP-PTEN组相比,NF-κB与FAK启动子的结合差异有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)PTEN通过PI3K/AKT/NF-κB通路抑制FAK的表达。(2)PTEN通过PI3K/AKT通路来调控NF-κB活性。(3)NF-κB是调控FAK转录水平的正向转录因子。(4)PTEN通过抑制NF-κB与FAK启动子的结合,从而抑制FAK基因转录和蛋白表达。