一、研究背景心力衰竭是由多种病生理因素共同导致的综合征,导致慢性心衰的重要病因及病理学改变是病理性心肌肥厚,随着对其发病机制不断深入研究,分子生物学水平的调节逐渐受到更多关注。近年来研究发现microRNA是参与调节心衰病理过程的重要机制之一。microRNA(miRNA)是长度为18-25个核苷酸的单链非编码小分子RNA,具有转录后调节特性。miRNA可形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),通过完全或不完全互补配对的方式特异性结合靶基因mRNA的3’非编码区,在转录后水平负调控靶基因蛋白表达,从而调节生物体多种病生理过程,在心血管疾病中可参与并调节血管新生、心肌肥厚、心肌细胞及间质纤维化、炎症反应、凋亡坏死等过程。心肌肥厚是以细胞体积增大、蛋白分泌增多及肌小节组织增加为特点的病理过程,其潜在触发因素为血流动力学紊乱、缺血损伤及神经内分泌失衡等多种病理条件,其内在机制为胎儿基因再表达、兴奋收缩耦联改变、能量代谢平衡改变等,已有研究表明许多miRNAs有正向或负向调节心脏肥厚的分子机制的功能。我们通过构建SD大鼠腹主动脉缩窄模型与心肌细胞肥大模型,检测miR-148a的表达水平,并与对照组对比;并进一步构建miR-148a过表达腺病毒与miR-148a inhibitor转染至大鼠心肌细胞中,观察细胞相关心衰标志分子的变化,明确miRNA-148a在心力衰竭中的作用,并进一步探讨miRNA-148a诱导心衰可能的靶基因。二、研究方法(一)构建大鼠腹主动脉缩窄模型订购180g~200gSD大鼠,禁食水24h后用10%水合氯醛麻醉,无菌环境下开腹,用4号丝线与外径为0.6mm的针管扎紧,移除针管,对照组不做结扎。饲养4w后处死取出心脏,利用HE染色观察心肌形态变化,并行定量PCR检测肥厚相关标志分子,确定模型构建成功。(二)构建原代心肌细胞肥大模型取出生1-2天的SD乳鼠,70%酒精消毒后无菌环境下取出心室,并用胶原酶消化,并用差速离心三次分离心肌细胞与成纤维细胞。常规培养心肌细胞两天后,加入Brdu,再无血清环境下培养24h,分别加入苯肾上腺素与血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大。(三)检测miR-148a在肥大模型中的表达用Trizol法常规提取大鼠心肌组织RNA和肥大心肌细胞RNA,定量后利用颈环结构的特异引物反转录microRNA,并行定量PCR检测,qRT-PCR使用SYRB GREEN MIX试剂盒。(四)构建过表达腺病毒与miR-148a inhibitor克隆相应microRNA前体序列,并插入pADTrack-CMV穿梭质粒,pmeⅠ线性化后转化进BJ5183感受态细菌,涂于卡那抗性LB板上过夜,Sganer测序筛选出正确的重组质粒,并用lip 2000将质粒转染进293A细胞包装病毒并扩增,测定病毒滴度。在www.mirbase.org网站上检索得到miR-148a的成熟序列,设计该序列的互补序列,对碱基进行2’甲氧修饰,其中合成和修饰序列由上海吉玛公司完成。(五)双荧光素酶报告基因生物信息学方法预测其靶基因,将MAP3K4的mRNA3’UTR区插入荧光素酶质粒中,再将质粒与miRNA148a过表达质粒共转染至293T细胞中,24h后裂解细胞,测定荧光素酶表达量并定量分析。(六)蛋白免疫印迹(western blot)microRNA过表达质粒转染进原代心肌细胞,用RIPA裂解液提取蛋白,行western blot检测分析靶基因蛋白表达情况,常规100v电泳,75v、2h湿转法转膜,并用5%牛奶封闭2h,4℃冰箱孵育一抗过夜。并用TBST反复洗涤三次,每次约15min,避光孵育二抗2h,TBST再次洗涤三次,用显影液显影,并在Odyssey红外激光扫描成像系统中扫描蛋白条带并分析,以进一步确定miRNA-148a能否调控MAP3K4表达。(七)统计学分析计量资料用平均数±标准差的方法表示,每组实验重复至少3次,组件采用两独立样本的t检验。我们默认以P<0.05作为显著性差异的标准。三、实验结果(一)心肌肥厚模型的验证1.SD大鼠心肌肥厚模型腹主动脉缩窄是最常见的大鼠心衰模型构建方法之一,本次实验中24只实验大鼠均成功存活,部分实验组SD大鼠出现消瘦,毛发稀疏等迹象。腹主动脉缩窄饲养4w的大鼠心脏外形明显大于对照组;另外实验组大鼠ANP、myh7显著升高,myh6则变化不明显;心脏HE染色切片有明显的肥厚改变,表明模型构建成功。2.原代心肌细胞肥大模型心肌细胞分离后分别经过PE与AngⅡ刺激,并用α-actinin抗体标记做免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下细胞直径和表面积都增加,细胞形态较为饱满,同时定量PCR结果验证。(二)miRNA-148a在肥厚模型中表达降低我们用定量PCR检测了在miRNA-148a在心肌组织以及PE、AngⅡ内的表达水平,结果显示在大鼠心肌肥厚及AngⅡ诱导的肥大模型内,miRNA-148a均表达下降,与既往的研究结果相符。(三)过表达miR-148a促进原代心肌细胞肥大用miRNA-148过表达腺病毒转染原代心肌细胞,48h后qRT-PCR检测miRNA-148表达量,与对照组相比,结果提示升高13倍左右,提示转染成功。检测ANP、myh6、myh7表达情况,其中ANP,myh7有显著升高,myh6无统计学差异,提示过表达miR-148a能促进心肌肥厚。(四)敲低miR-148a可部分逆转心肌细胞肥大构建miR-148a inhibitor并转染PE诱导的肥大心肌细胞,定量PCR检测miR-148a表达水平;结果提示miR-148a表达下降约60%,可有效抑制其表达;同时其ANP表达水平比PE刺激组相比有明显下降,但较基础水平仍有升高;提示降低miR-148a表达可部分逆转心肌细胞肥大。(五)miRNA-148a抑制MAP3K4的表达应用TargetScan、microRNAorg等数据库检索预测表明MAP3K4可能为miR-148a的潜在靶基因,故用双荧光素酶报告基因验证,进一步探讨miR-148a调控心衰的潜在机制,结果显示过表达miR-148a能显著抑制MAP3K4-3’UTR区荧光素酶表达,提示MAP3K4为miR-148a的靶基因。将过表达miR-148a过表达腺病毒转染进原代心肌细胞中,western blot结果显示在MAP3K4蛋白表达水平明显降低,该结果同样提示MAP3K4为miR-148a的靶基因。四、实验结论在成功构建的大鼠腹主动脉缩窄模型与心肌细胞肥大模型中,ANP、myh7显著升高,myh6表达降低或无统计学差异,同时miRNA-148a表达降低。在心肌细胞中过表达miRNA-148a,能促进心肌细胞肥大,同时心肌细胞中敲低miR-148a,则可部分逆转细胞肥大。miRNA-148a靶向作用于MAP3K4并能抑制该基因的表达,可能是通过该途径来促进心肌细胞肥大。