肿瘤发生机制及治疗对策的研究是当今医学研究的重点，其中以诱导分化治疗、基因治疗和“启动细胞天然自杀机制------细胞凋亡”三大治疗模式尤为引人注目。视黄酸(retinoic acid,RA)是维生素A的体内活性代谢产物，具有多种生理生化功能。RA的许多生物学效应是通过其胞内核受体介导的，视黄酸核受体可分为RAR和RXR两个超家族，每个超家族都含有α、β和γ三个成员。RA与其受体的同源或异源二聚体(RXR／RXR、RAR／RXR)结合后，活化的受体能与靶基因上的视黄酸反应元件(retinoic acid response element,RARE)结合而调节下游基因表达。近年来通过体内外及临床实验研究表明，RA可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡。目前全反式视黄酸(ATRA)和13顺式视黄酸(13-cRA)已用于血液肿瘤、肺癌、肾癌、黑色素细胞瘤、神经胶质细胞瘤等多种癌症的临床治疗，并取得了较好的疗效。但是，近年来发现应用RA治疗存在一定的缺点，即易复发或肿瘤患者对RA出现抵抗或耐药，推测其机理可能与视黄酸胞内核受体RAR基因易位和／或突变，以及异常融合基因的形成有关，但确切分子机制尚不清楚，因此探索克服RA耐药的方法、发挥RA疗效具有重要的临床意义。 细胞凋亡(程序性死亡)是机体生长、分化、发育和病理过程中由基因编码调控的细胞主动自杀现象，是近年来基础研究领域的热点之一，本课题拟通过直接诱导肿瘤细胞凋亡，进而对分子机制尚不清楚的RA抗性细胞进行有效治疗。 Fas抗原是细胞凋亡机制中启动凋亡的信号分子之一，亦称APO-1或CD95，是与细胞凋亡密切相关的细胞表面分子之一，其与特异性配体FasL结合后可诱导ras（＋）细胞的“自杀”，现己证实ras诱发的细胞自杀与其胞内 60J0个氨基酸组成的“死亡区（Death domain，DD＊’有关，Fas与抗干as或FasL结合能引起Fas死亡区交联或聚化，启动死亡信号传导，引发下游凋亡效应的发生。RA与其核受体 RARa的配体结合区（LBD）作用可导致受体形成三聚体，根据这一特性推测构建含Fas抗原死亡区和RAR LBD区的融合蛋白，外源性RA即可经KARa聚合作用启动融合蛋 一白中 Fas介导的死亡信号。本课题中构建含Fas死亡区和RARa LBD融合基因表达载体的同时，在融合基因上游插入RARE调控序列的启动子，使其自身表达亦受RA调控，转导肿瘤细胞后，进而观察RA依赖细胞凋亡效应的发生，为克服s抗性提供实验基础，并进一步分析凋亡发生的分子机制。 本研究首先构建了含有RARE调控元件的绿色荧光蛋白（eGFP）报。告基因表达载体，并验证了RA可调控带有KARE的eGFP表达，初步确定了该载体模型的可应用性；进而，应用DNA重组技术构建了带有RAILE的融合基因 Fas／RAR a表达载体中RAREIas／RAR a人 并采用 RTICR和荧光显微镜直接观测方法证实了 pRAREFas／KAR a转染细胞后融合基因的表达受KA精确调控；同时运用MTT试验、’－m－aEL检测、透射电镜观测、DNA梯形带检测、流式细胞分析、RT－PCR以及蛋白免疫印迹等W技术手段，探讨了 RA及其诱导的融合基因 Fas／RAR a表达启动的凋亡效应及其可能的分子机制。 本课题主要研究结果如下： 1．运用DNA重组技术构建了带有3个RARE重复序列的eGFP真核表达载体中RARE七GFP），经脂质体方法转染 HL60细胞，G4筛选稳定表达后，分别以IX10”’mol／L、SX10”mol／L和IX10“mol／LRA处理l～Zd，RT．PCR和荧光显微镜直接观测发现eGFP蛋白表达明显升高，撤除RA处理因素后表达有所下降。提示RA可诱导带有RARE－TK启动子的外源基因表达，且呈限时高效表达，推测以此为模板构建RA依赖融合基因 Fas／RAR a表达载体是可行的。 x 二．成功构建了含有 RARE－TK启动子和报告基因 eGFP的 FasffLAR a真 核表达载体中趴REfas／RAR a人 转染HL60和MCF刀细胞，经G418 筛选阳性细胞克隆后，以不同剂量RA分别处理24、48、72小时，RT｛CR 和荧光显微镜直接观测报告基因eGFP表达，结果显示eGFP表达呈Aw 时间剂量依赖性升高，提示融合蛋白 Fas用AR a表达亦呈 RA时间剂量依－赖性上升。说明 RA可调控的 FSS爪人R。融合基因表达载体模型构建成功。 3．p…＊as／RAR a转染和未转染的 HL60和 MCF刁细胞经 RA处理 后，经荧光显微镜观测绿色荧光蛋白（即融合蛋白）分布于细胞整体，进 一步提取细胞胞浆和胞膜蛋白组分行SDS－PAGE证实融合蛋白主要定位 于细胞膜上。 4．pRAREIas／RAR a转染和未转染的 HL60和 MCFJ细胞经 RA处理。后，细胞生长减慢、细胞周期被阻滞在G；G。期、凋亡率增加，并可检测 到DNA梯形带，透射电镜和TUNEL法发现其形态结构呈凋亡性变，凋 亡阳性细胞率增加。其中，以融合基因转染细胞经RA处理后变化更为显 著。说明RA可经RARE调控融合基因表达诱发细胞凋亡，且该效应与RA 自身抑制增殖、促进凋亡作用相互协同。 5．