金华火腿是中国著名的传统肉制品之一,在民间常作为滋补礼品馈赠亲友,但对其功效原理却知其然而不知其所以然,对其中起作用的功能成分物质仍不能确认。过去几十年的研究主要针对火腿的原料选择,工艺过程优化,以及控制蛋白质脂肪在加工过程中的降解程度等,这些研究的核心目的是为了提高产品的风味和质量。而现代社会消费者越来越关注营养膳食。传统的金华火腿需要8-10个月的生产过程。在长期加工过程中,蛋白质发生降解产生了大量长短不同的肽段和游离氨基酸。但对金华火腿中大量肽段功能特性的研究还是空白。随着天然抗氧化肽研究的日渐深入,对金华火腿中富含的大量肽类物质功能特性的研究也越来越受到重视。本研究提取金华火腿粗肽液,通过体外和体内试验验证其抗氧化活性;针对提取、加工、贮存以及经人体消化吸收过程中可能遇到的环境进行模拟,研究金华火腿抗氧化肽的稳定性;最后提取鉴定金华火腿中发挥作用的抗氧化肽;并初步研究了抗氧化肽实际应用的可能性。具体研究内容和结果如下:1金华火腿粗肽液的体外与体内抗氧化活性研究本部分提取金华火腿粗肽液,测定粗肽液清除自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化的能力,衡量金华火腿粗肽液的体外抗氧化能力。采用动物模型衡量金华火腿粗肽液的体内抗氧化作用。测定了小鼠血清、肝脏、胰腺与十二指肠中抗氧化酶的活性,丙二醛(MDA)含量的变化,肌肉中乳酸的蓄积情况,较全面的评价了金华火腿粗肽液的生理活性。研究结果显示:随着金华火腿粗肽液浓度的增加,抗氧化能力显著增加(P<0.05)。在金华火腿粗肽液浓度为1.5 mg/mL时,清除羟基(·OH)自由基能力高达90%;浓度为5mg/mL时,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基能力高达95%;金华火腿粗肽液螯合金属离子的能力显著高于BHT和GSH;并能一定程度抑制脂质过氧化和蛋白质氧化。添加金华火腿粗肽液能显著降低小鼠血清磷酸肌酸含量,并能使血清中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)以及总抗氧化能力(T-AOC)恢复到正常水平。低肽液添加组小鼠的肝脏组织、胰腺组织中MDA含量分别比氧化组降低了 67%与15%(P<0.05)。高肽液添加组小鼠胰腺组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-PX含量均能恢复到正常水平。添加金华火腿粗肽液能提高十二指肠的T-AOC(P<0.05)。此外,金华火腿粗肽液能够在一定程度上减少小鼠肌肉乳酸的蓄积,起到一定的抗疲劳作用。总之,金华火腿粗肽液在体外试验与体内试验中均表现出较强的抗氧化活性。2金华火腿粗肽液的抗氧化稳定性研究本部分研究了金华火腿抗氧化肽在不同的食盐含量、温度、pH、光照强度以及模拟胃肠道消化体系过程中的抗氧化稳定性。结果表明:当食盐含量低于6%,温度不超过60℃,并且避光保存条件下,抗氧化肽能很好的保持其活性(P<0.05)。酸性和中性环境对其抗氧化活性影响不显著,而碱性条件导致其活性下降。在模拟胃肠道消化过程中,从游离氨基酸比例的变化可以看出胃蛋白酶主要将多肤水解成小片段,而胰蛋白酶能将多肽水解得更加彻底,释放出更多的游离氨基酸。胃蛋白酶处理提高了抗氧化活性,但经胰蛋白酶继续处理后,抗氧化活性有所下降,这也可能与胰蛋白酶水解后产生了更多的游离氨基酸,而降低了其表面疏水性有关,但亚铁离子螯合能力显著增加。总之,消化后产物的抗氧化活性与消化前相比差异不显著,说明金华火腿抗氧化肽在经模拟胃肠道消化后仍能很好的保持其抗氧化活力。3金华火腿抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定本部分利用凝胶层析法对金华火腿粗肽液进行初步分离,将其分为A、B、C、D与E五部分。将每部分分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行体外模拟胃肠道消化试验,测定酶解前后抗氧化活性的变化。酶解前组分C、D、E具有很强的清除自由基能力,而酶解后组分C、D、E螯合亚铁离子能力显著提高到90%(P<0.05),因此选择酶解前后的C、D、E组分分别进行进一步分离纯化,最后采用液相色谱-质谱联用技术鉴定出起主要作用的抗氧化肽序列。消化前后得到鉴定的肽序列为33条,对其中丰度值最高的七条进行了合成,并测定了七条肽段的体外抗氧化活性。肽段LPGGGHGDL清除·OH自由基的活性最强,GKFNV清除DPPH·自由基的活性达到92.7%,KEER可能对消化后极强的亚铁离子螯合能力起主要作用。总之,在金华火腿产品中以及经过胃肠道消化后都会产生抗氧化活性极强的抗氧化肽。4金华火腿与美国市售火腿的抗氧化活性比较研究本部分选取了美国东南部六种不同加工工艺和生产周期的火腿,六种火腿的加工周期从3个月到2年不等,加工工艺也分为烟熏、非烟熏、熟制、非熟制。提取火腿中的粗肽液,通过对粗肽液清除自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化能力的测定,与金华火腿粗肽液的抗氧化活性作比较。以此来衡量不同生产周期、加工工艺与抗氧化活性的关系。结果表明:与美国六种市售火腿相比,金华火腿粗肽液的食盐含量显著高于其它样品,肽的含量较低,抗氧化活性处于较高水平。食盐含量影响内源蛋白酶的活力,进而影响火腿产品中肽段的组成,而肽段的组成比肽的含量更能反映肽液的抗氧化活性。5金华火腿抗氧化肽在腊肠中的应用本部分提取金华火腿粗肽液,将金华火腿粗肽液以0.01、0.03、0.05、0.07 g/100g肉重的比例分别添加入广式腊肠中,并与0.01 g/100g的化学抗氧化剂BHT作对照。腊肠成品贮存于37℃恒温箱,在贮存0、5、10、15、20天分别取样。通过测定腊肠脂肪氧化、蛋白质氧化以及抗氧化酶的活性变化情况,衡量金华火腿粗肽液的实际抗氧化能力。结果表明:随着添加量的增加,金华火腿粗肽液的抗氧化能力显著增加。在浓度为0.05 g/100g时,其对脂肪氧化、蛋白质氧化的抑制能力,以及对抗氧化酶活力的保持能力在贮藏的中后期明显优于空白组(P<0.05)。添加金华火腿粗肽液组腊肠对脂肪氧化的抑制能力不及化学抗氧化剂BHT,但对蛋白质氧化的抑制能力,对抗氧化酶活力的保持能力较强。通过试验得出:金华火腿粗肽液对广式腊肠有较好的抗氧化作用,可作为天然抗氧化剂使用。