论文部分内容阅读
目的:探讨骨髓间充质干细胞—透明质酸复合物对大鼠放射性溃疡创面的影响及其可能的作用机制。
方法:①分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29,CD31,CD44,CD45,以明确分离培养的细胞为MSCs。通过体外诱导使其分化为脂肪细胞,采用油红0染色鉴定分化的脂肪细胞,证实MSCs的多向分化潜能。②将透明质酸与MSCs联合培养,通过观察细胞悬液在生物载体上的扩散程度来判断透明质酸载体亲水性大小,通过观察细胞悬液在生物载体上是否飘动来判断透明质酸载体对细胞粘附力,并检测MSCs的细胞表面标志、细胞周期及分化为脂肪细胞的潜能。③采用Sr—90皮肤敷贴器,以45Gy剂量体外照射SD大鼠臀部两侧皮肤,造成放射性皮肤溃疡动物模型,观察大鼠皮肤创面炎症反应,检测创面组织羟脯氨酸含量,判断愈合情况。④将MSCs—透明质酸复合物移植入皮肤创面,比较MSCs—透明质酸复合物组、透明质酸组、空白对照组的创面愈合率,HE染色进行组织学观察,Ⅷ因子免疫组化进行微血管计数,检测创面组织羟脯氨酸含量判断愈合质量。荧光显微镜下观察CM—DiI标记MSCs,以检测MSCs的迁移分布。
结果:⑴采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞,细胞接种于培养瓶后,原代细胞经过24h后可见大量细胞贴壁生长,48~72h后开始伸展,6~8d后贴壁细胞数目明显增多,细胞生长进入指数生长期。传代细胞生长至第3代后,细胞形态渐趋一致。经流式细胞仪检测,骨髓间充质干细胞表面特异抗原CD29和CD44呈高表达,不表达CD31和CD45。骨髓间充质干细胞经成脂诱导后,油红0染色阳性,保持了成脂分化的潜能。⑵透明质酸与骨髓间充质干细胞共同培养显示,透明质酸具有较强的亲水性,对骨髓间充质干细胞的吸附力强。经流式细胞仪检测,MSCs—透明质酸复合物细胞表面标志物与骨髓间充质干细胞一致。MSCs—透明质酸复合物保持了成脂分化的潜能。细胞周期分析显示,MSCs—透明质酸复合物G1+G2期细胞为94.2%,骨髓间充质干细胞G1+G2期细胞为95.5%,提示均为低分化细胞,符合干细胞特性。⑶采用Sr—90皮肤敷贴器体外照射大鼠皮肤45min,剂量为45Gy,可导致大鼠放射性皮肤溃疡。照射2~3周后,局部皮肤出现溃疡。照射后5周溃疡不再增大。照射后6~9周,溃疡周围可见新生上皮长入,伤口收缩迟缓。创面羟脯氨酸含量较正常对照皮肤显著降低。⑷MSCs—透明质酸复合物移植到创面后,荧光显微镜下可见CM—DiI标记的MSCs。MSCs—透明质酸复合物组创面愈合率、羟脯氨酸含量显著高于透明质酸组和对照组,Ⅷ因子免疫组化阳性细胞增多,微血管计数显著高于透明质酸组和对照组,组织学观察显示,MSCs—透明质酸复合物移植术后2~3周,可见表皮新生。Masson染色可见胶原纤维平行于创面排列。
结论:①MSCs体外培养生长稳定,传代后仍保持未分化状态,具有多分化潜能。②透明质酸与MSCs联合培养,未改变MSCs的特性及体外分化能力,且透明质酸与MSCs组织相容性好,对MSCs无毒性作用。③采用Sr—90皮肤敷贴器体外照射大鼠皮肤45min,45Gy剂量可导致大鼠放射性皮肤溃疡。④以MSCs作为种子细胞,透明质酸作为负载材料,将MSCs—透明质酸复合物移植入放射性皮肤溃疡创面,对皮肤缺损具有促进愈合的作用,可改善创面愈合质量。