论文部分内容阅读
目的:矽肺是长期吸入大量游离二氧化硅引起的,一种以持续性炎症和不可逆纤维化为特征的职业性肺部疾病,是尘肺中最常见、进展最快、危害最严重的类型。矽肺发病机制尚未完全明确,缺乏临床特效治疗措施,仍是世界范围内最受关注的公共卫生问题之一。我们之前的研究曾证实自噬在矽肺发生发展过程中具有重要作用。虽然肺组织已有的纤维化病变为非可逆性病变且难以消除,但肺纤维化的发病是个慢性、进行性的病理反应过程,从改善自噬溶酶体系统功能的角度寻找治疗的靶标,以延缓肺纤维化的发展进程为目的,仍具有重要的现实意义。本研究探讨转录因子EB在矽尘导致肺部炎症和纤维化中的可能作用机制,并进一步探究海藻糖对实验性矽肺纤维化保护作用的可能机制,以期为矽肺纤维化病程的延缓及治疗提供潜在靶标。研究方法:本研究通过气管非暴露式灌注二氧化硅悬液,构建C57BL/6小鼠矽肺动物模型。利用Western Blot、qRT-PCR和免疫荧光对矽尘暴露早期(7天)和晚期(56天)实验性矽肺模型小鼠肺组织及肺泡巨噬细胞(AMs)中TFEB进行检测,得出矽尘暴露小鼠肺组织及AMs细胞中TFEB入核增多,表达升高。运用MH-S细胞建立体外矽尘暴露模型和TFEB沉默及过表达细胞系,验证TFEB在矽肺模型中的可能作用及机制。使用Western Blot、TUNEL和ELISA,检测TFEB沉默和过表达对体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡和炎症的影响,得出TFEB沉默加重凋亡和炎症,而TFEB过表达起到了缓解作用。通过给予自噬阻断剂,应用Western Blot确认矽尘暴露导致MH-S细胞自噬降解受阻。通过Western Blot、吖啶橙染色、Lysotracker染色及免疫荧光检测进一步确认TFEB过表达对矽尘暴露导致MH-S细胞自噬溶酶体系统的影响。同时应用自噬阻断剂,运用TUNEL和ELISA的方法,进一步证实TFEB过表达减轻矽尘暴露导致的MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌是否与自噬溶酶体系统有关。上述实验用以说明TFEB在矽尘暴露MH-S细胞中的的作用。给予矽尘暴露小鼠2 g/kg海藻糖(Tre),应用Western Blot、qRT-PCR和免疫荧光对各实验小鼠肺组织及AMs中TFEB进行检测。应用Western Blot及免疫荧光检测Tre对矽肺模型自噬溶酶体系统的影响。应用Western Blot、ELISA和HE染色检测Tre对矽尘暴露导致肺部凋亡和炎症的影响。体外给予矽尘暴露MH-S细胞50 mmol/L Tre,运用Western Blot、qRT-PCR检测TFEB的变化情况。并通过构建LC3-GFP-mRFP转染MH-S细胞系,动态观察Tre对自噬的调控。运用TFEB沉默细胞系和Tre两种处理方式,采用Western Blot、吖啶橙染色、Lysotracker染色及免疫荧光检测方法,进一步证实Tre通过TFEB对矽肺模型的自噬溶酶体系统进行调控。采用Western Blot、TUNEL和ELISA检测方法,检测Tre对矽尘暴露MH-S细胞凋亡和炎症的影响。采用羟脯胺酸测定、Western Blot和免疫组织化学(Col-1、Fn)确定Tre对矽尘暴露导致肺组织纤维化的影响,应用Masson染色观察Tre对矽尘暴露导致肺组织纤维化的影响。上述实验用以说明Tre对实验性矽肺纤维化缓解作用的可能机制。结果:1、矽尘暴露小鼠肺组织和AMs细胞中TFEB核转移增加Western Blot、Realtime-PCR、免疫组化和免疫荧光的方法检测矽尘暴7天和56天TFEB的变化。Western Blot结果显示:在矽尘暴露7天、56天,与对照组相比,CS组小鼠肺组织TFEB核蛋白的表达显著升高(P<0.05);RealtimePCR结果显示,与对照组相比,CS组小鼠肺组织TFEB基因表达显著升高(P<0.05);免疫组化和免疫荧光结果显示,与对照组相比,CS组小鼠肺泡巨噬细胞TFEB核蛋白表达增多;Realtime-PCR检测在矽尘暴露7天、56天TFEB的变化,与对照组相比,CS组小鼠肺泡巨噬细胞TFEB基因表达显著升高(P<0.05)。2、TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌通过Western Blot和Realtime-PCR检测,与对照组比较,CS暴露导致MHS细胞TFEB核转移增加,基因表达升高(P<0.05)。建立TFEB沉默MH-S细胞系,通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与对照组比较,CS暴露导致MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌增多,TFEB沉默加重CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌(P<0.05)。3、TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌建立TFEB过表达MH-S细胞系。通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与对照组比较,CS暴露导致MH-S细胞凋亡和炎性因子的分泌增多,TFEB过表达减轻CS诱导的MH-S细胞凋亡及炎性因子的分泌(P<0.05)。4、TFEB过表达通过自噬在矽尘暴露MH-S细胞模型中发挥抗凋亡及抗炎性因子分泌的作用Western Blot结果显示,与对照组相比,CS组MH-S细胞表达自噬相关蛋白LC3II,Beclin1和Atg5的水平均显著升高,TFEB过表达进一步促进了CS诱导的Beclin1和Atg5升高,却使LC3II蛋白表达降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,CS组MH-S细胞表达溶酶体表面膜相关蛋白LAMP1的水平均显著降低,TFEB过表达减轻了CS诱导的LAMP1降低(P<0.05)。此外Lysotracker Red和AO染色检测同样发现,CS组MH-S细胞溶酶体红色荧光降低,TFEB过表达减轻了CS诱导的酸性结构的碱化。免疫荧光结果显示,CS导致MH-S细胞LAMP1表达降低,LC3II升高,LAMP1与LC3II共定位减少,提示二者结合减少。与CS组相比,TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞LAMP1表达升高,LC3II降低,LAMP1与LC3II共定位增多,提示二者结合增多;Western Blot结果显示,TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞升高的p62降低(P<0.05);免疫荧光共定位同样发现CS导致MH-S细胞p62升高,Ubiquitin蛋白表达升高,二者共定位升高,提示CS导致MH-S细胞自噬底物沉积增多;TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞p62降低,Ubiquitin蛋白表达升高二者共定位减少,提示TFEB过表达使CS处理的MH-S细胞自噬底物沉积降低。通过自噬抑制剂BAF、CQ和3MA来干预自噬流,TUNEL和ELISA结果显示,TFEB过表达通过自噬溶酶体途径,减轻CS诱导的巨噬细胞凋亡和炎性细胞因子分泌(P<0.05)。5、Tre激活TFEB并调控矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞自噬相关蛋白的表达Western Blot结果显示:在矽尘暴露7天、56天,与CS组相比,CS+Tre组小鼠肺组织TFEB核蛋白的表达显著升高(P<0.05)。Realtime-PCR检测结果显示,与CS组相比,CS+Tre组小鼠肺组织TFEB mRNA表达显著升高(P<0.05)。免疫荧光结果显示,与CS组比较,CS+Tre组小鼠AMs细胞TFEB入核增多。Realtime-PCR结果显示,CS+Tre组与CS组比较,小鼠AMs细胞中TFEB mRNA表达显著升高(P<0.05)。Western Blot结果显示,检测矽尘暴露7天、56天肺组织,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II、Atg5和Beclin1表达显著升高;与CS组比较,CS+Tre组自噬相关蛋白Beclin1和Atg5的水平均显著升高,而LC3II的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。免疫荧光结果显示,在矽尘暴露7天、56天AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II表达升高;与CS组比较,CS+Tre组LC3II的蛋白表达水平显著降低。Western Blot结果显示,在矽尘暴露7天、56天AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS组自噬相关蛋白LC3II和Atg5表达显著升高;与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达自噬相关蛋白Atg5的水平显著升高,而LC3II的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,在肺组织和AMs细胞中均发现,与Ctrl组比较,CS组溶酶体表面膜蛋白LAMP1表达降低;与CS组比较,CS+Tre组LAMP1表达明显升高(P<0.05)。对肺泡灌洗液中CTSB蛋白进行Western Blot检测发现,CS组CTSB蛋白分泌量显著增加,Tre干预有效减少肺泡灌洗液中CTSB蛋白分泌量。Western Blot结果显示,矽肺模型小鼠肺组织中,与Ctrl组比较,CS使肺组织中p62和Ubiqutin蛋白表达显著增加;与CS组比较,CS+Tre组有效减少了p62和Ubiqutin蛋白的沉积(P<0.05)。矽肺模型小鼠AMs细胞中,与Ctrl组比较,CS使AMs细胞p62蛋白表达显著增加;与CS组比较,CS+Tre组有效减少了p62蛋白的沉积(P<0.05)。免疫荧光同样发现,Tre能够有效减少小鼠AMs细胞中p62蛋白的沉积。6、Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织凋亡及炎症Western Blot结果显示,与对照组比较,CS暴露导致矽肺模型小鼠肺组织和AMs细胞凋亡加重,Tre干预减轻了矽肺模型小鼠的凋亡(P<0.05)。ELISA结果显示,与Ctrl组比较,CS使7天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、TNF-α和IL-1β蛋白分泌量显著增加,56天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液,除IL-6以外其它蛋白均显著增加;与CS组比较,CS+Tre使7天、56天矽肺模型小鼠肺泡灌洗液中炎性因子分泌量显著降低(除56天IL-6以外)(P<0.05)。HE染色检测结果显示,与对照组小鼠相比,CS组小鼠肺组织结构遭到破坏,7天矽肺模型小鼠观察到肺组织中存在大量炎性细胞浸润;56天矽肺模型小鼠观察到明显的细胞结节。Tre进行干预处理的矽肺模型小鼠,可以观察到炎性细胞浸润减轻,纤维细胞结节大小明显降低。7、Tre激活TFEB并调控体外矽尘暴露MH-S细胞自噬相关蛋白的表达Western Blot结果显示:矽尘暴露使MH-S细胞TFEB入核增多,Tre进一步促进CS处理的MH-S细胞TFEB入核增多(P<0.05)。Realtime-PCR结果显示,与对照组相比,CS组MH-S细胞TFEB基因表达升高;与CS组比较,CS+Tre组TFEB基因表达进一步升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。mRFP-GFP-LC3结果显示:Tre增强了体外矽肺MH-S细胞自噬流,促进了自噬底物的降解;Western Blot结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达自噬相关蛋白Beclin1和Atg5的水平均显著升高,而LC3II的蛋白表达水平显著降低,CS+Tre+sh-TFEB与CS或CS+Tre比较均发现LC3II、Beclin1和Atg5显著降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞表达溶酶体表面膜蛋白LAMP1显著增高,上清液中CTSB明显减少,CS+Tre+sh-TFEB与CS+Tre组比较发现,sh-TFEB逆转了Tre对矽肺MH-S细胞LAMP1和CTSB的作用(P<0.05)。此外Lysotracker Red和AO染色检测同样发现,Tre减轻了CS对MH-S细胞酸性结构的破坏,而sh-TFEB使Tre这一功能丧失。免疫荧光结果显示,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞LAMP1表达升高,LC3II降低,LAMP1与LC3II共定位增多,而CS+Tre+sh-TFEB组,LAMP1与LC3II表达均降低;Western Blot结果显示,Tre使CS处理的MH-S细胞p62蛋白表达降低,而CS+Tre+sh-TFEB组,显示sh-TFEB抵消了Tre促进p62降解的作用(P<0.05)。免疫荧光发现,与CS组比较,CS+Tre组MH-S细胞p62表达降低,Ubiquitin蛋白减少,二者共定位减少,而CS+Tre+sh-TFEB组与CS+Tre组比较,发现MH-S细胞p62表达升高,Ubiquitin蛋白增多,二者共定位增多。提示海藻糖通过TFEB使CS处理的MH-S细胞自噬底物沉积减少。8、Tre通过TFEB减轻体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡及炎性因子的释放通过Western Blot、TUNEL和ELISA方法检测凋亡和炎性因子的分泌情况,与CS组比较,CS+Tre组,减轻细胞凋亡、使炎性因子的分泌减少,而CS+Tre+sh-TFEB组,使Tre的抗凋亡、抗炎作用丧失(P<0.05)。9、Tre减轻矽肺模型小鼠肺组织纤维化对矽尘暴露56天后的各组小鼠肺组织进行羟脯氨酸含量测定(HYP)、Col-1和Fn蛋白检测,石蜡切片进行Col-1和Fn蛋白检测和Masson三色染色。HYP结果显示,与Ctrl组比较,CS暴露小鼠肺组织中,羟脯氨酸含量明显增加,与CS组比较,Tre处理后,CS暴露小鼠肺组织中,羟脯氨酸含量显著降低(P<0.05)。Western Blot和免疫组化结果显示,Tre有效减轻了矽尘暴露小鼠肺组织Col-1和Fn蛋白的表达(P<0.05)。Masson染色结果显示,Ctrl组小鼠肺组织并未出现明显的胶原沉积,而在矽尘暴露组小鼠肺组织中,纤维结节病变处出现明显的胶原沉积,给予Tre处理后小鼠纤维结节病变明显减少,肺部胶原沉积明显降低(P<0.05)。结论:1、矽尘暴露小鼠肺组织和AMs细胞中TFEB入核增多,表达增高。2、沉默TFEB使体外矽尘暴露MH-S细胞凋亡炎症加重,而过表达TFEB使凋亡和炎症减轻。3、TFEB过表达通过改善自噬溶酶体系统以自噬依赖的方式减轻矽尘导致的MH-S细胞凋亡和炎性因子的释放。4、海藻糖通过TFEB促进矽肺模型自噬溶酶体系统功能的恢复。5、海藻糖通过TFEB减轻矽肺模型凋亡和炎性因子的释放。6、海藻糖减轻矽尘暴露小鼠肺组织纤维化。