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围食膜(peritrophic membrane,PM)是昆虫中肠天然防御体系,主要由几丁质和蛋白质组成。本研究以农业上重要的鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)为对象,构建其中肠cDNA文库,分离和鉴定新的PM靶标蛋白,明确靶标蛋白的生理功能,探讨PM与病原微生物相互作用的分子机理,寻找生物防治新靶标,将为发展新的高效生物杀虫剂提供理论依据。利用Stratagene公司cDNA合成试剂盒,成功构建了高质量的甜菜夜蛾和棉铃虫中肠cDNA表达文库,原始文库滴度分别为5.51×10~6pfu/ml和4.82×10~6 pfu/ml,重组率分别为99.97%和99.79%,文库扩增后滴度分别为2.41×10~9pfu/ml和1.5×10~9pfu/ml,平均插入片段分别约为1.8kb和2.0kb。提取甜菜夜蛾围食膜蛋白,成功制备了甜菜夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体;过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测甜菜夜蛾和棉铃虫围食膜和中肠组织蛋白组成,发现围食膜中糖蛋白含量很高,中肠组织中糖蛋白含量低。利用免疫筛选方法,从甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库中筛选得到肠粘蛋白克隆SeI1-120共120个以及围食膜蛋白阳性克隆SeM1-92共92个。其中seⅡM-6,seⅡM-8和seⅡM-20基因均与粘虫肠粘蛋白相似性最高,但5‘端缺少未知的氨基酸序列。SeⅡM-6和SeⅡM-20分别编码4个和3个几丁质结合功能域;SeⅡM-8具有5个几丁质结合功能域(CBD),一个类粘蛋白结构域和一个在昆虫蛋白中首次发现的天冬氨酸富集区,GenBank登录号为EU047712。利用抗体差异筛选方法,从甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库筛选得到围食膜蛋白阳性克隆SeP1-162共162个。以4.8kb的seP159基因为模板,设计引物,扩增得到包含信号肽和几丁质结合功能域的基因p1226,克隆并表达,Westernbot验证了该蛋白的表达。secbp66基因编码围食膜蛋白,其核苷酸序列GenBank登录号为EU139126。结构域分析表明,SeCBP66具有一个17个氨基酸的信号肽,包含7个几丁质蛋白结合功能域(CBD),最长读码框(ORF)编码602个氨基酸,与粘虫(Mamestra configurata)围食膜蛋白pcritrophin 1的相似性最高,为48%;构建了携带围食膜蛋白基因secbp66的重组表达载体pQE-SeCBP66,pMal-SeCBP66,pET-SeCBP66,在大肠杆菌中表达140kDa的目的蛋白;构建了SeCBP66重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达;几丁质结合实验表明SeCBP66具有几丁质结合活性;为了研究单个CBD的结构和功能,以secbp66基因为模板,PCR扩增得到携带信号肽和一个几丁质结合功能域的基因cbdl,构建了原核表达载体pQE30-CBDl,Spot blot鉴定在大肠杆菌中表达了目的蛋白;构建CBDl重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达。用粉纹夜蛾肠粘蛋白多克隆抗体,免疫筛选甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库,得到羧酸酯酶基因secl,GenBank登录号为EF580101;构建该基因的原核表达载体pET-secl和pQE-secl,分别在大肠杆菌中获得表达;构建SeCl重组杆状病毒表达载体,实现了重组病毒在昆虫细胞系的表达;以a-醋酸萘酯为底物,检测羧酸酯酶活性为1.3nmol/100μl酶液。从棉铃虫中肠cDNA表达文库中筛选得到编码肠粘蛋白的基因片断hat12,hat15,hat46(haiim-46)和一个编码新的棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86全长cDNA克隆。这3个基因片断大小分别为1772bp,1728 bp,2857bp;其中haiim-46基因编码的棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM-46,具有3个粘蛋白结构域,8个几丁质结合域,缺少氨基端信号肽序列。Hat50基因全长1487bp,结构域分析其氨基端缺少信号肽序列,具有2个几丁质结合功能域,这2个CBD间有一个甘氨酸-天冬氨酸富集区。编码HaⅡM86的cDNA全长3147bp,包括ORF2,517bp,GenBank登录号为EU136045;结构域分析表明,HaⅡM86N-端带有16个氨基酸的信号肽序列,具有5个CBD,一个粘蛋白结构域,两个甘氨酸-天冬氨酸富集区;这两个甘氨酸-天冬氨酸富集区分别位于第3,第4和第4,第5个CBD之间,第1个甘氨酸富集区中序列CDGSCPDNGGNDGN重复2次,第2个甘氨酸富集区内,序列NDGG重复达20次。该区域同甜菜夜蛾肠粘蛋白SeⅡM-8中的甘氨酸富集区相似,是首次在昆虫蛋白中发现,其在围食膜蛋白结构中的作用还尚未可知。将该粘蛋白基因克隆到原核表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15,Western blot检测其表达了约200kDa的蛋白;构建了携带HaⅡM86基因的重组病毒,实现了重组蛋白HaⅡM86在昆虫细胞中的表达;昆虫杆状病毒系统表达的HaⅡM86具有几丁质结合活性,能够被1%Calcofour洗脱,能够被棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白Enhancin降解。本研究中的一个重要发现是棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白Enhancin能够降解HaⅡM86,这为棉铃虫的生物防治提供了新思路;此外,对棉铃虫肠粘蛋白HaⅡM86的结构域分析,尤其是甘氨酸-天冬氨酸富集区的发现,扩充了昆虫围食膜蛋白的种类,为探索围食膜的结构和生理功能提供了依据。