奶牛乳腺炎是影响奶牛养殖业健康发展的最严重的制约因素之一,给整个产业链带来了严重的危害。本研究通过采集江苏、山东多家奶牛场乳腺炎奶样和常规奶样,开展奶牛乳腺炎流行病学调查,利用细菌学方法分离培养病原菌,16S rDNA测序鉴定,确定采样牧场乳腺炎病原菌流行状况,建立小型病原菌菌种库,结合奶牛场DHI测定,分析细菌感染模式和乳品质性状的相关性,在药敏试验基础上,检测主要流行菌肺炎克雷伯杆菌的耐药基因,为揭示奶牛乳腺炎病原菌感染规律和耐药机制,开展奶牛乳腺炎抗性选育提供实验依据。本研究主要包括以下几个方面。一、奶牛乳腺炎病原菌的分离和16S rDNA基因序列分析鉴定:对江苏、山东等地牧场进行流行病学调查,分离和鉴定乳腺炎病原菌。随机采集牧场1、牧场2、牧场3、和牧场4的常规乳样共882份(n1=223,n2=220,n3=193,n4=246),利用细菌学和16s rDNA测序确定病原菌种属。结果显示:牧场1的乳腺炎样本分离出11种病原菌39株;牧场2的乳腺炎样本分离出15种病原菌38株;牧场的乳腺炎样本分离出6种病原菌12株;牧场4乳腺炎样本分离出3种病原菌4株。牧场1的常规奶样分离出36种病原菌228株;牧场2的常规奶样分离出的32种病原菌275株;牧场3的常规奶样分离出42种病原菌226株;牧场4的常规奶样中分离出67种病原菌322株。二、探索奶牛乳腺炎的细菌感染模式与乳成分、体细胞数之间的关系。对四个地区奶样分离菌的感染模式分类:单菌感染、两菌混合感染和三菌混合感染,并整理其对应的D HI检测数据,利用单因素方差分析和相关性分析。结果表明:1.不同细菌的感染模式对于真蛋白率、脂肪率、粗蛋白率、总固形物率差异不显著(P>0.05),SCC在不同的细菌感染模式之间差异不显著(P>0.05)。2.随着SCC范围的增加,乳成分中真蛋白率、脂肪率、粗蛋白率、和总固形物率,在SCC小于300千/ml与其他三组间差异显著(P<0.05)。乳成分中真蛋白率、脂肪率、粗蛋白率、总固形物率在SCC大于300小于1000千/ml的范围时组间差异不显著(P>0.05),乳成分中真蛋白率、脂肪率、粗蛋白率和总固形物率在大于500千/ml范围时组间差异不显著(P>0.05)。在SCC小于300千/ml和大于1000千/ml范围时,乳成分中真蛋白率、脂肪率、粗蛋白率和总固形物率组间差异不显著(P>0.05)。揭示细菌感染模式与乳成分之间没有相关性,乳中SCC的变化影响乳中其他性状的变化。三、乳腺炎分离病原菌的药物敏感性:采用NCLLS药敏试验标准和纸片扩散法检测乳腺炎分离菌对6种药物(氨苄西林、环丙沙星、林可霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素)的敏感性,结果表明:从四个牧场分离到菌株对于林可霉素表示全部耐药,其实验的抑菌圈为零。四个牧场奶牛乳腺炎样本的分离菌几乎全部对氨苄西林、林可霉素和青霉素表示耐药,其中牧场2分离出的地衣芽孢杆菌、牧场4分离出的解糖肠球菌、奇异变形杆菌表示敏感,牧场2的恶臭假单胞菌表示中敏。对于环丙沙星、庆大霉素和链霉素表示敏感。其中牧场1分离出的嗜碱芽孢杆菌、铜绿假单胞菌表示耐药,枯草芽孢杆菌表现中敏。四、对牧场1分离出的38株肺炎克雷伯杆菌的抗性基因检测:肺炎克雷伯杆菌引起奶牛乳房炎的病例在逐年增多,具有病程长、易反复感染等特点。通过药敏试验确定38株肺炎克雷伯杆菌的耐药情况,通过PCR凝胶电泳分析确定耐药基因的阳性率。β-内酰胺酶类基因 TEM、SHV、LEN、OKP、CTX-M-I group、CTX-M-2 group、CTX-M-9 gr oup、PER、GESVEB,氨基糖苷类基因 aac(6’)-Ib、aadA4/5、aadA6/16、aph(3’)-I、aph(3)-IIb,外排泵mdfA接合型质粒遗传标记traA、trbC,插入序列遗传标记IS 1133,喹诺酮类 gyrA、parC,16s rRNA 甲基化酶基因 armA、nrmtA、rmtB、rmt C、rmtD共28个基因,结果在38株肺炎克雷伯杆菌中28中基因的检出率如下:β内酰胺酶类的OPK(100%)、TEM(42.11%),SHV(68.42%),LEN(97.37%),则其他 CTX-M-Igrowup、CTX-M-2 group、CTX-M-9 group、PER、GE 和V的检出率为零。氨基糖苷类 aac(6’)-Ib(31.68%),aph(3’)-I(78.95%),aph(3’)-Ⅱb(13.16%),aad A4/5和aadA6/16的检出率为零。外排泵mdfA(15.79%),接合性质粒遗传标记trbC(76.32%),trbA的检出率为零。插入序列遗传标记IS1133(21.05%),转座子遗传标记Int 12(21.05%),merA 的检出率为零,喹诺酮类的parC(100%),gyrA(81.58%),16S rRNA 甲基化酶rmtA(100%),rmtB(86.84%),rmtD)(7.89%),armA 和rmtC 的检出率为零。多数菌株含有多个抗性基因组合。2,药敏试验结果分析:在38株肺炎克雷伯杆菌中,89.47%对氨苄西林耐药,34.21%对头孢噻吩耐药、7.89%对头孢哌酮耐药、39.47%对头孢他啶耐药、50.00%对阿莫西林耐药、73.68%对青霉素耐药,18.42%对哌啦西林耐药,与β-内酰胺酶类抗性基因密切相关;7.89%对庆大霉素耐药、7.89%对妥布霉素耐药,与氨基糖苷类抗性基因相关;34.21%对氯霉素耐药,与喹诺酮类抗性基因有关;31.58%对四环素耐药;对头孢噻肟、环丙沙星、美罗培南敏感。一些可移动遗传元件对于耐药基因的转移有着密不可分的关系。实验结果的复杂性同样也提示着细菌的耐药机制的复杂性。