研究背景:低强度超声治疗在促进骨愈合、软骨修复、加速糖尿病足溃疡恢复、缓解慢性炎症疼痛等大量临床实践中被证实具有稳定而可靠的治疗效果。在肿瘤治疗研究领域,近年来有大量体外及动物实验证实,低强度超声可以在肿瘤治疗中起到一定的作用。低强度超声治疗对肿瘤的作用包括两方面:直接损伤作用杀伤肿瘤细胞/组织,如声动力学疗法;间接增强其他治疗手段对肿瘤组织的杀伤作用,如通过超声空化、声孔效应等增强放疗、化疗、基因转染疗效。近年挪威的一项I期临床实验证实,低强度超声联合微泡可以显著增强胰腺癌患者吉西他滨化疗疗效。微泡具有降低超声空化阈值、增强超声空化效应的作用。大量在体研究证实,血管内微泡在低强度超声辐照下会产生显著的血流阻断效应,引起肿瘤毛细血管扩张、水肿、出血等病理损伤,显著降低肿瘤血流灌注,并继而引起肿瘤细胞坏死、肿瘤生长抑制等。低强度超声引起肿瘤血流灌注下降的效应被称为超声的抗血管效应。然而同时也有研究证实,低强度超声辐照联合微泡还可引起血管扩张及血流灌注增加。暂时性的肿瘤血流灌注量增加有助于改善肿瘤乏氧、乏血供状态,缓解肿瘤局部低pH、高组织间隙压力的微环境,从而增强肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性,增强肿瘤放化疗的疗效。低强度超声激励微泡空化作用的血管效应多样性与肿瘤组织血管结构的不均质性以及超声空化效应的复杂性均有关系。超声脉冲宽度、重复频率、声压等参数的改变均会影响超声空化效应的类型(稳态/瞬态空化)及强度,从而影响其血管效应。基于上述原因,我们分别采用高声压治疗超声仪以及改进的可调控诊断超声仪对动物肿瘤模型进行不同能量参数的低强度超声激励微泡空化实验,旨在观察不同类型的低强度超声激励微泡空化的血管影响效应,并进一步探究其在肿瘤治疗中的可能应用。目的:1.研究高声压低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流对肿瘤无水酒精消融的增强作用。2.研究诊断级低强度超声激励微泡空化对肌肉及肿瘤组织的血管效应及其机制,进一步探讨低强度超声激励微泡空化增敏肿瘤化疗的可能。材料与方法:1.主要实验仪器:(1)ACUSON S2000超声诊断仪,配备9L4高频线阵探头,用于低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流实验中肿瘤常规超声及超声造影成像。(2)CZ-960脉冲式超声治疗仪,探头频率831 kHz,用于低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流实验。本研究所采用的超声参数为:超声脉冲宽度300个周期(约0.36 ms),脉冲重复频率10 Hz(脉冲间隔约100 ms)、峰值负压4.3 MPa,发射/间歇时间6s/6s,总工作时间5 min,经换算占空比为0.18%,平均声强1.25 W/cm2。(3)经过适应性改进的彩色多普勒超声诊断仪VINNO 70,配备X4-12L线阵探头,飞依诺科技(苏州)有限公司生产,具备专门的微泡空化调控组件Vflash。该组件在低机械指数超声造影成像程序上叠加可调式Vflash治疗脉冲超声波发射程序,具有在低机械指数造影模式下实时监测瞬时Vflash脉冲发射的功能。本研究所采用的诊断级低强度超声参数为:探头频率4 MHz,脉冲宽度18个周期(约4.5μs),脉冲重复频率50 Hz,发射/间歇时间0.48 s/2 s,线密度4档,声功率50%/100%(分别对应机械指数0.7/1.4),总辐照时间10 min/20 min。(4)Varioskan Flash全波长多功能酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司生产,可进行荧光和化学发光、光吸收检测。(5)Waters Alliance E2695高效液相色谱仪,沃特世科技(上海)有限公司生产,HPLC分离系统用于组织药物浓度检测。2.主要实验试剂:(1)“脂氟显”微泡造影剂,为第三军医大学新桥医院超声科研制实验用试剂,外层为脂质成分包膜,核心气体为惰性气体全氟丙烷,微泡平均粒径2.0μm,浓度2-9×109/ml。在本研究中作为造影剂及空化核应用于超声造影成像及低强度超声空化治疗。(2)一氧化氮检测试剂盒(S0021)及组织与细胞裂解液(一氧化氮检测用)(S3039),购自碧云天生物技术有限公司,采用经典Griess法测定一氧化氮浓度。(3)荧光素钠盐,购自美国Sigma公司,为小分子荧光物质,分子量376.27。(4)BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S),购自碧云天生物技术有限公司,采用BCA法测定蛋白浓度,用于一氧化氮及荧光素钠浓度检测的蛋白浓度标定。3.实验动物:(1)健康4周龄SD乳鼠3只,雌雄不限,用于Walker-256腹水原代肿瘤细胞培养。(2)健康雌性SD大鼠28只,体质量160-180g,建立单侧皮下Walker-256肿瘤模型,用于低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流增强无水酒精消融实验。(3)健康雄性6周龄裸鼠40只,体质量12-15g,用于诊断级低强度超声激励微泡空化对肌肉组织血管影响效应的观察及机制研究。(4)健康雄性4周龄裸鼠44只,体质量10-12g,32只建立双侧下肢皮下胰腺癌肿瘤模型,用于诊断级低强度超声激励微泡空化对肿瘤组织血管影响效应的观察及其机制研究;另12只建立单侧下肢肿瘤模型,用于诊断级低强度超声激励微泡空化增敏肿瘤化疗实验研究。4.实验方法:(1)高声压低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流增强无水酒精消融研究:(1)动物模型建立:Walker-256肿瘤细胞常规复苏培养,待细胞浓度达107/ml时,接种于4周龄乳鼠腹腔,待腹水生成后抽取腹水并提取原代肿瘤细胞,以0.1 ml细胞悬液(5-8×107/ml)注射于28只6周龄SD大鼠皮下建立下肢荷Walker-256肿瘤模型。(2)高声压低强度超声治疗:荷瘤鼠随机分为3组,分别为超声治疗组(n=8)、无水酒精注射组(n=10)以及超声联合酒精组(n=10)。超声治疗组经尾静脉缓慢推注稀释的脂质微泡0.5 ml(浓度约5×108/ml),同时使用高声压低强度超声于肿瘤表面辐照5 min;无水酒精注射组于超声引导下瘤内注射无水酒精0.3 ml;超声联合酒精组首先对肿瘤进行低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流治疗,随后于瘤内注射等量无水酒精。(3)血流阻断效应评价指标:治疗前、治疗后即刻(除无水酒精注射组外)及24小时行超声造影检查并定量分析肿瘤区域时间强度曲线,得到峰值强度(Peak Intensity,PI)、曲线下面积(Area Under Curve,AUC)、达峰时间(Time to Peak,Tp)以及平均渡越时间(Mean Transit Time,MTT)值进行统计分析;取动物肿瘤标本3个不相邻切面计算坏死区面积/整体面积得到肿瘤坏死率。(2)诊断级低强度超声激励微泡空化对正常肌肉血管效应的观察及其机制研究:(1)动物分组及低强度超声治疗:40只健康裸鼠根据所采用的超声治疗参数变量——机械指数(Mechanical Index,MI)及治疗时间(Time,T)随机分入四组(n=10):MI0.7T10 min组,MI0.7T20 min组,MI1.4T10 min组,MI1.4T20 min组,每组10只。经尾静脉团注脂质微泡造影剂0.02 ml同时使用相应参数(MI=0.7/1.4,T=10/20 min)的诊断级低强度超声在单侧肢体表面行超声辐照。(2)血流灌注增强效应评价指标:各组治疗前后对双侧小腿肌肉群同时行超声造影检查并定量分析对应肌肉区域时间强度曲线,分别得到治疗侧及对照侧治疗前后PI值及AUC值,计算治疗侧与对照侧比值PIT/PIC及AUCT/AUCC,统计分析治疗前后两组比值间差异。(3)一氧化氮浓度检测:每组5只动物,分别获取治疗侧及对照侧肌肉,按说明书步骤检测一氧化氮浓度。(4)荧光素钠渗出量检测:每组5只动物于治疗开始前注射0.5%荧光素钠溶液0.2ml,治疗后造影结束后经心脏灌注排尽血流后获取治疗侧及对照侧肌肉组织,充分匀浆离心后取上清,测定激发光波长437 nm,发射光518 nm波段荧光强度,计算荧光素钠渗出量。(3)诊断级低强度超声激励微泡空化对肿瘤血管效应的观察及其增敏化疗的效应研究:(1)32只双侧荷瘤裸鼠,动物分组、低强度超声治疗、血流灌注评价、一氧化氮浓度检测以及荧光素钠渗出量检测方法同第(2)部分。(2)诊断级低强度超声激励微泡空化增敏化疗作用研究:12只单侧下肢皮下荷瘤鼠,随机分入超声+吉西他滨组(US+GEM,n=6)和单独吉西他滨组(GEM,n=6)。US+GEM组经静脉注射化疗药物吉西他滨后,进行低强度超声联合微泡治疗;GEM组仅经静脉注射化疗药物。超声治疗参数选择MI=0.7,治疗时间20 min。于治疗结束后处死动物获取肿瘤组织,高效液相色谱法测定组织药物浓度。结果:1.高声压低强度超声激励微泡空化阻断肿瘤血流增强无水酒精消融研究:(1)超声治疗组和联合治疗组治疗后即刻造影均可见肿瘤内部大范围非增强负性显影,PI值及AUC值与治疗前比较均有显著下降(P<0.05);与治疗前相比,24 h后各组肿瘤造影PI值及AUC值均有显著下降,其中超声空化组PI值下降了30.9%,AUC值下降了43.4%,无水酒精消融组PI值下降了46.3%,AUC值下降了52.5%,联合治疗组PI值下降了84.8%,AUC值下降了90.1%,其差异均有统计学意义(P<0.05);(2)各组肿瘤坏死率分别为:超声空化组(66.17±12.54)%,无水酒精消融组(81.02±8.23)%,联合治疗组(97.50±1.84)%,联合治疗组肿瘤坏死率显著高于其他两组(P<0.01)。病理观察可见各组肿瘤内部均为大范围凝固性坏死。2.诊断级低强度超声激励微泡空化对正常肌肉血管效应的观察及其机制研究:(1)超声空化治疗后,MI0.7T10 min组、MI0.7T20 min组、MI1.4T10 min组、MI1.4T20 min组治疗侧与对照侧肌肉峰值强度比(PIT/PIC)较治疗前分别增加了7%,18%,16%,9%,而曲线下面积比(AUCT/AUCC)分别增加了约9%,28%,31%,15%,统计学结果显示各组治疗后PIT/PIC及AUCT/AUCC值较治疗前均有统计学差异(P<0.05)。(2)超声治疗后各组治疗测NO浓度均高于对照侧(P<0.05),而NaFI浓度与对照测比较均无统计学差异(P>0.05)。3.诊断级低强度超声激励微泡空化对肿瘤血管效应的观察及其增敏化疗的效应研究:(1)超声空化治疗后四组治疗侧与对照侧肿瘤组织峰值强度比(PIT/PIC)及曲线下面积比(AUCT/AUCC)与治疗前比较均无统计学差异(P>0.05)。(2)超声空化治疗后各组治疗测NO浓度与对照侧比较均无统计学差异(P>0.05).(3)超声空化治疗后MI0.7T20 min组肿瘤治疗侧与对照侧NaFI渗出量差异有统计学意义(P<0.05),其余各组均无统计学差异(P>0.05)。(4)治疗参数为MI0.7T20 min组低强度超声激励微泡联合经静脉化疗药物治疗后,US+GEM组药物浓度较GEM组增加了约2.5倍,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.高峰值负压的低强度超声联合微泡作用可引起肿瘤血流灌注量的显著下降,与经皮瘤内无水酒精注射疗法联合使用能够增强其消融作用,增加肿瘤坏死率;2.诊断级低强度超声刺激微泡空化效应可引起正常肌肉组织血流灌注量的显著增加及一氧化氮生成量的增加。3.诊断级低强度超声(MI0.7T20min)刺激微泡空化作用可引起裸鼠皮下胰腺癌肿瘤模型小分子药物通透性升高,增加局部药物浓度。